罗非鱼无乳链球菌C5a肽酶(ScpB)的原核表达及其免疫原性

以尼罗罗非鱼（Oreochromisniloticus）为鱼体样本，克隆了罗非鱼源无乳链球菌（Streptococcusagalactiae）scpB基因，构建了原核表达质粒pET32a（＋）-scpB，转入大肠杆菌BL2I（DE3）后，IPTG诱导表达，表达的重组蛋白经镍离子金属螯合柱纯化及超滤管浓缩后，进行SDS-PAGE和Westernblot分析鉴定。纯化的重组蛋白以不同剂量（1μg/g、3μg/g、5μg／g）免疫尼罗罗非鱼后，每周检测各实验组鱼体血清非特异性免疫指标[溶菌酶活性、超氧化物歧化酶（SOD）活力]及抗体水平变化情况，并于免疫4周后以4倍LD50的剂量对其进行人工攻毒。结果显示，该重组蛋白在大肠杆菌中以包涵体的形式存在；对尼罗罗非鱼的相对免疫保护率为69．66％-89．00％，其中5pg儋组的相对保护率最高；受免鱼体血清中溶菌酶活性、SOD活力和抗体水平较对照组有极显著提高（P〈0．01），结果表明，重组蛋白ScpB具有较强的免疫原性和保护作用。本研究旨在为GBS多肽疫苗的研制奠定基础。

罗非鱼无乳链球菌C5a肽酶的克隆及原核表达质粒构建

为进一步了解无乳链球菌表面蛋白C5a肽酶scpB基因免疫表位及毒力作用基团的相关信息,通过提取罗非鱼无乳链球菌基因组DNA,利用特异性引物PCR扩增出scpB基因的全长开放阅读框(ORF)。结果表明,该基因包括3 405 bp的ORF,可编码1 134个氨基酸,与已报道的人源无乳链球菌ScpB的氨基酸同源性达99.74%。利用生物信息学软件DNAstar、Clustal X 2.0和MEGA 5.05及在线分析工具ExPASy ProtParam、NCBIProten blast及Conserved Domain等对推导的氨基酸序列进行分析,结果显示罗非鱼无乳链球菌scpB基因编码的氨基酸序列含有3个催化三联体(catalytic triad)位点、7个假定活性位点(putative active site)、2个特异位点(spe-cific hits),以及4个超家族结构(2个肽酶超家族结构Peptidases-S8-S53 superfamily、1个类纤连蛋白超家族结构DUF1034 superfamily和1个鞭毛钩蛋白超家族结构FlgD-lg superfamily);并且该氨基酸序列有多个抗原表位,推测ScpB蛋白应具有较强的免疫原性,可作为候选的蛋白疫苗成分。将该片段插入原核表达载体pET32a(+),转入大肠杆菌BL21(DE3),挑取阳性克隆,经PCR、酶切及测序鉴定表明成功构建原核表达载体pET32a(+)/scpB。

B族链球菌C5a肽酶功能活性区域的分段表达

目的表达B族链球菌C5a肽酶蛋白功能活性区域,为进一步研究及开发疫苗奠定基础。方法设计引物,从GBSⅡ型标准株的基因组DNA中扩增出含有C5a肽酶蛋白不同功能区域基因的4个目的片段,分别插入T载体,再经酶切后,插入原核表达载体PET32a,进行融合表达。对表达蛋白进行免疫原性检测,并通过镍柱大量纯化。结果成功构建4个目的片段的PET表达质粒。经SDS-PAGE检测表达的融合蛋白相对分子质量分别为80000、78000、70000和36000。蛋白质谱分析证实,表达的4个蛋白为B族链球菌C5a肽酶蛋白的可能性分数分别为82、152、113和79。免疫印迹证实均能与特异性抗C5a肽酶蛋白的抗体反应,纯化后的蛋白SDS-PAGE纯度达90%。结论已成功地表达了可溶性C5a肽酶蛋白4个功能活性区域,为蛋白免疫表位和毒力机制的研究以及亚单位蛋白疫苗的制备奠定了基础。

儿童对A群链球菌C5a肽酶的免疫应答

A群链球菌C5a肽酶(SCPA)是促进A群链球菌局部感染建立的一个主要表面毒力蛋白(GAS)，作者使用了标准的间接酶联免疫吸附检测方法测定了对SCPA的免疫应答，并测量了与GAS相关的小儿咽炎急性期和恢复期的双份血清样本，证明了对SCPA的免疫应答不受感染的M型和病人年龄的影响，

B族链球菌C5a肽酶表位的预测、分段表达及其免疫原性

目的应用生物信息学方法预测B族链球菌C5a肽酶蛋白(SCPB)的表位,分段表达其中4个功能活性区域,并分析其免疫原性。方法用预测程序ProPred和ANTIGENIC预测SCPB的表位;分别构建C5a肽酶4个目的片段的重组表达质粒,经酶切测序正确后,转化E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析目的蛋白的表达形式及表达量;并经镍柱亲和层析纯化,纯化的重组蛋白进行蛋白质谱分析和Western blot分析后,皮下免疫小鼠,ELISA检测小鼠血清抗体水平。结果经预测,SCPB含1个既可结合MHC又具有B细胞表位特征的肽段。构建的4个重组表达质粒经酶切及测序鉴定正确,目的蛋白主要以可溶性形式表达,表达量约占菌体总蛋白的30%～70%。纯化的重组蛋白纯度可达90%,质谱分析表明与SCPB的相似性很高;Western blot分析表明,可与兔抗全长SCPB多克隆抗体反应。重组F1、FE、Fn蛋白免疫小鼠血清抗体滴度较高,三者差异无统计学意义;F2a蛋白抗体滴度最低,与F1、FE和Fn蛋白差异有统计学意义。结论已成功构建并高效表达了SCPB的4个功能活性区域;Fn是重要的免疫优势表位功能区;本文为B族链球菌毒力机制的研究及亚单位蛋白疫苗的研制奠定了基础。

B族链球菌C5a肽酶蛋白表位的克隆、表达和免疫学分析

目的应用生物信息学方法预测B族链球菌C5a肽酶蛋白表位,结合基因工程手段进行表位重组、表达和免疫原性分析。方法用预测程序ProPred和ANTIGENIC预测B族链球菌C5a肽酶蛋白的表位,应用PCR技术扩增出编码该表位基因片段,克隆PCR产物构建重组质粒,测序验证。在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达融合蛋白。表达的蛋白经质谱分析和Western blot鉴定。纯化该融合蛋白并免疫C57／BL小鼠,萃取GBS表面蛋白,双向琼脂扩散试验检测抗体水平。结果在SCPB中预测到1个既具有MHC结合肽特性又具有B细胞表位特征的肽段。重组和表达了这一肽段,质谱得出与SCPB蛋白的相似性分数为79,Western blot证实能与抗SCPB的抗体反应,纯化后融合蛋白纯度>90％。动物实验证实融合蛋白能产生特异性的抗GBS抗体。结论重组表位具有一定免疫原性,为相关蛋白的毒力机制研究和亚单位疫苗等方面的研究打下了良好的基础。

B族链球菌表面蛋白C5a肽酶系统及鼻内黏膜免疫的研究

目的研究B族链球菌表面蛋白C5a肽酶（streptococcal C5a peptidase，ScpB）系统及其鼻内途径免疫后在小鼠血清及肺、直肠、阴道等黏膜部位特异性抗体水平，探讨ScpB蛋白黏膜免疫应答的效果。方法在大肠杆菌BL21中表达ScpB蛋白，亲和层析法进行纯化，质谱分析法对所纯化的蛋白进行鉴定。小鼠随机分为5组，每组10只。分别为对照组、皮下30μg组、鼻内5μg组、鼻内10μg组和鼻内30μg组。用ELISA法检测小鼠血清及黏膜萃取液中特异性抗体水平；调理吞噬试验检测ScpB蛋白抗血清的保护性功能。结果成功表达并纯化了ScpB蛋白；质谱分析和蛋白质库比较证实其为B族链球菌表面蛋白C5a肽酶的可能性分值为175；ELISA显示ScpB蛋白皮下30μg及鼻内不同剂量（5μg、10μg、30μg）免疫后均可诱发小鼠产生高水平特异性IgG抗体（P〈0．01），30μg剂量组IgG大于5μg及10μg剂量组（P〈0．05）；鼻内不同剂量（5μg、10μg、30μg）免疫后均可诱发小鼠产生高水平的黏膜特异性IgA抗体，与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．01）；黏膜免疫组间无差异；30μg ScpB蛋白皮下免疫后黏膜特异性IgA抗体与对照组相比差异无统计学意义（P〉0．05）。ScpB抗血清对细菌具有调理吞噬作用，吞噬指数为12．3，与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．05）。结论B族链球菌表面蛋白C5a肽酶鼻内途径免疫小鼠后可在血清、肺及阴道、直肠等免疫近端和远端黏膜中产生相应高水平IgG及IgA抗体，上述ScpB抗体具有促进吞噬细胞吞噬B族链球菌的功能。