GNM C7-8实时荧光PCR系统对掺假肉制品中多种动物源性成分的同时检测

应用GNMC7-8实时荧光PCR系统,同时快速检测掺假肉制品中多种动物源性成分。将牛肉粉、驴肉粉、鸵鸟肉粉和羊肉粉4组不同肉粉中分别混入猪肉粉、鸭肉粉、马肉粉、鸡肉粉和狐狸肉粉中的2~3种肉粉,制备人工模拟掺假肉制品。通过GNMC7-8实时荧光PCR和ABI7500荧光PCR方法,对上述四种掺假肉制品进行多种动物源性成分检测和比较。结果表明,GNMC7-8实时荧光PCR方法与ABI7500荧光PCR方法从掺假肉制品中检测猪、鸭、马、鸡和狐狸5种成分的循环数一致,分别是31、31、29、32和25,但基于八模块设计的GNMC7-8实时荧光PCR方法能同时检测四种掺假肉制品中不同动物源性成分,检测时间更短。因此,GNMC7-8实时荧光PCR系统的八个模块能够独立运行,互不干扰,无交叉污染,能够实现对掺假肉制品中多种动物源性成分的同时快速检测,为肉制品掺假检测提供强有力的方法支持。

GNM C7-8实时荧光PCR同时快速检测8种动物源性成分

目的基于八模块设计的GNM C7-8实时荧光PCR系统实现对8种动物源性成分同时快速检测.方法基于猪朊蛋白基因、牛生长激素基因、羊生长激素基因、驴线粒体ATPase 6基因、马线粒体ATPase 6基因、鸭生长激素基因、水貂线粒体细胞色素b基因、狐狸线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ亚基基因引物设计了8种动物源性成分实时荧光PCR检测方法.应用GNM C7-8实时荧光PCR系统,对8种动物源性成分启动同时检测和每隔5 min顺序启动不同时检测,并将检测结果和ABI 7500荧光PCR分别检测结果进行比较.结果GNM C7-8实时荧光PCR系统同时检测猪、牛、羊、驴、马、鸭、水貂、狐狸8种动物源性成分,起峰周期数分别为30、27、21、21、24、17、15、17,与其不同时检测结果一样,与ABI 7500荧光PCR系统检测结果相比,猪、羊、马、鸭、水貂5种成分的起峰快1~2个周期数,其余3种成分检测结果一致,检测完成时间少16~20 min.结论GNM C7-8实时荧光PCR系统8个模块独立运行,互不干扰,无交叉污染,能够同时快速检测8种动物源性成分,为快速筛查动物源性成分提供强有力的设备技术支持.

GNM C7-8实时荧光定量PCR同时快速检测8种食源性致病菌

目的基于GNM C7-8实时荧光定量PCR系统实现对8种常见食源性病原菌的同时快速检测。方法以建立的8种常见食源性致病菌的基于内参系统的实时荧光PCR检测方法为参照,基于GNM C7-8实时荧光定量PCR系统,对上述病原菌进行同一时间点和不同时间点的同时快速检测,并将检测结果同常见的ABI7500和罗氏荧光定量PCR仪检测结果进行比较。结果基于八模块设计的GNM C7-8实时荧光定量PCR系统能够在同一时间点和不同时间点启动运行,并实现对8种病原菌的同时快速检测;不同病原体的检测体系独立运行,互不干扰,不易发生交叉污染;与其他2种荧光定量PCR仪相比,扩增结果一致,但是完成检测所需时间更短。结论对于食物中毒和疫病爆发等突发性重大公共卫生事件的应急处置,GNM C7-8实时荧光定量PCR系统将可以提供强有力的设备支持。

转基因甜菜H7-1实时荧光PCR检测方法

运用实时荧光PCR方法对转基因甜菜H 7-1外源基因FMV 35 S启动子、E 9 3’终止子、CP 4-EPSPS外源基因和品系特异性进行了检测。建立了快速、准确的转基因甜菜H 7-1转基因成分的PCR检测方法。本研究采用的FMV 35 S启动子、E 9 3’终止子、CP 4-EPSPS和品系特异性检测引物探针能有效检测转基因甜菜H 7-1中转基因成分,具有特异性,且灵敏度达到0.01%。

清肺口服液对呼吸道合胞病毒感染人胚肺成纤维细胞ICAM-1、IL-8 mRNA基因表达的影响

目的:探讨清肺口服液含药血清对呼吸道合胞病毒(RSV)感染的人胚肺成纤维细胞(HELF)细胞间黏附分子(ICAM-1)、白细胞介素-8(IL-8)基因表达的影响。方法:RSV攻击体外培养的HELF细胞后,以清肺口服液含药血清,利巴韦林含药血清及空白血清干预,采用实时荧光定量PCR法(RealTime-PCR)测定各组人胚肺成纤维细胞ICAM-1、IL-8 mRNA表达变化。结果:病毒感染后ICAM-1、IL-8以GAPDH为内参的△Ct值明显小于正常细胞组及生理盐水血清对照组,而清肺口服液含药血清、利巴韦林含药血清作用后△Ct值显著增大。结论:(1)RSV病毒作用后ICAM-1及IL-8 mRNA表达水平显著升高;(2)清肺口服液可以降低ICAM-1、IL-8的表达,缓解RSV感染后细胞的异常变化,起到间接预防RSV肺炎的作用。

白细胞介素-8基因单核苷酸多态性与宫颈癌易感关系的研究

目的:探讨白细胞介素-8(IL-8)基因单核苷酸多态性(SNP)与宫颈癌易感的关系。方法:选择2021年1月至2022年7月佛山市南海区妇幼保健院收治的宫颈癌患者144例为观察组,选择同期健康体检者270例为对照组。采集两组的血液标本,并完成标本中相关基因DNA的提取,采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法分析IL-8基因的目标片段,并完成目标DNA片段的回收、纯化和测序,总结IL-8基因SNP与宫颈癌易感的关系。结果:两组的IL-8基因SNP均经Hardy-Wniberg平衡检验,说明入组人群均源于同一孟德尔群体,并达到遗传平衡状态。观察组和对照组的基因型、等位基因存在差异,观察组的AT等位基因检出率低于对照组(P<0.05),TT等位基因检出率高于对照组(P<0.05)。IL-8基因SNP(AT+TT)检出率在不同年龄宫颈癌患者中无统计学差异(P>0.05);在不同肿瘤类型、临床分期、组织分级及肿瘤直径宫颈癌患者中具有统计学差异(P<0.05)。结论:IL-8基因SNP在宫颈癌患者中表达异常,且宫颈癌的发生多与IL-8-251A/T基因多态性有关,其有望成为宫颈癌治疗的新靶点。

四种水稻蛋白与水稻黑条矮缩病毒编码非结构蛋白P7-2的互作分析

水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)是斐济病毒属的成员之一,可侵染玉米和水稻等作物,给亚洲地区的田间生产带来严重的损失。RBSDV有10条双链RNA(double strand RNA,dsRNA)基因组,编码12个蛋白。其中6个蛋白是病毒粒子的结构成分(P1,P2,P3,P4,P8,P10),6个非结构蛋白分别为P5,P6,P7-1,P7-2,P9-1,P9-2。在非结构蛋白中,P5,P6和P9-1已被证实参与形成毒质结构,P7-1被认为可在细胞质中形成类似管状的结构作为病毒胞间扩散的通道,P7-2和P9-2的功能目前尚不明确。文章采用Pull-Down和液相色谱—质谱联用(LC-MS/MS)等技术来鉴定水稻蛋白(日本晴)与P7-2蛋白间可能存在的互作关系。通过Pull-Down实验分析,发现有4种水稻蛋白可与P7-2相结合,其中2个蛋白为转录相关蛋白,1个为氨基转移酶,还有1个为假定的分子伴侣60前体。实时荧光定量PCR分析显示,感病寄主中的转录相关蛋白和假定的分子伴侣60前体的表达量上调,而氨基转移酶的表达量降低。

TaqMan探针实时PCR检测人MTHFR基因C677T多态性方法的建立

目的建立TaqMan探针实时PCR检测人MTHFR基因C677T多态性的方法。方法设计一对MTHFR基因C677T多态位点的引物及TaqMan探针,采用TaqMan探针实时PCR扩增SNP分型方法检测唇腭裂患者及其父母共100人的MTHFR基因C677T多态性,与常规PCR-RFLP方法进行一致率比较,并对其特异性、敏感性和重复性以及成本-效益等进行评价,同时对部分实时PCR产物样本进行测序验证。结果运用TaqMan探针实时荧光PCR技术对MTHFR基因C677T多态性检测结果准确,特异性好,与常规PCR-RFLP方法结果具有高度一致性,Kappa=0.922>0.75(P=0.000);检测灵敏度可达2×103拷贝;重复性好、高通量、无污染、安全性好;随机样品TaqMan探针分型结果与测序结果完全一致。结论成功建立了TaqMan探针实时PCR检测人MTHFR基因C677T多态性的方法;此方法是常规临床诊断及大规模群体研究的良好平台。

中药对镍暴露氧化损伤抑制作用

目的研究灌服中药扶正解毒汤（FJD）后兔血清对硫酸镍（NiSO4）暴露的人支气管上皮细胞（16HBE）自由基含量及8-羟基-2-脱氧鸟苷三磷酸酶（8-oxo-dGTPase）表达的影响。方法体外培养的16HBE细胞分别经NiSO4暴露及NiSO4加扶正解毒汤含药血清共同处理后,采用激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）及实时荧光定量RT-PCR检测自由基含量及8-oxo-dGTPase表达的变化。结果NiSO4（800μmol/L）暴露的16HBE细胞,其自由基含量及8-oxo-dGTPase表达水平均高于NiSO4与扶正解毒汤（10%）共处理组细胞,P〈0.05~0.01,相对标准偏差（RSD）〉2%。结论8-oxo-dGTPase可作为镍暴露氧化应激的标记物;中药扶正解毒汤通过清除自由基,下调8-oxo-dGTPase的表达,对镍暴露氧化损伤具有显著的抑制作用。

脑缺血-再灌注损伤后S100A8的表达及意义

目的探讨脑缺血-再灌注（I／R）损伤后S100A8的表达变化及其与Toll样受体4（TLR4）的关系。方法TLR4基因突变型小鼠C3H／HeJ（n=30）随机（随机数字法）分力模型组（n=18）和健康组（n=12），TLR4野生型小鼠C3H／HeN（n=30）随机分为模型组（n=18）和健康健康组组（n=12），采用线栓法制造局灶性脑缺血-再灌注损伤模型，再灌注12h后进行神经功能缺损评分，通过TTC染色和HE染色评价各组脑组织损伤程度，实时定量PCR技术和免疫荧光成像检测各组S100A8 mRNA和蛋白的表达。结果与C3H／HeN模型组比较，脑缺血-再灌注损伤12h后，C3H／HeJ模型组神经缺损评分明显减小（P〈0．01），脑梗死体积和神经细胞损伤程度也明显减轻（P〈0．01）。与健康组比较，C3H／HeJ和C3H／HeN模型组梗死侧脑组织中S100A8mRNA和蛋白表达显著上调，且C3H／HeN模型组脑组织中S100A8表达量较C3H／HeJ模型组增加更为明显（P〈0．01），提示S100A8表达与TLR4关系密切。结论S100A8很有可能通过与TLR4相互作用在脑I／R炎症损伤早期过程中发挥重要作用。

乳制品及婴幼儿配方食品中蜡样芽孢杆菌的快速检测

蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)是一种常见的食源性致病菌,通过产生腹泻毒素和呕吐毒素导致食物中毒。针对蜡样芽孢杆菌的特异性卵磷脂-水解磷脂酶C基因(pc-plc)进行实时荧光PCR检测,开发出一种新的快速检测方法,能够快速准确地检测乳制品及婴幼儿配方食品中的蜡样芽孢杆菌。该方法具有较高的特异性,灵敏度可达150 g-1。人工污染实验表明,在婴儿米粉中蜡样芽孢杆菌检测灵敏度可到200 g-1;在巴氏杀菌乳、酸奶、婴幼儿奶粉中检测灵敏度为103g-1。

接骨草HMGR基因cDNA克隆、不同器官中的差异表达及生物信息学分析

目的克隆接骨草Sambucus chinensis 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因并分析其差异表达。方法采用RT-PCR方法获得HMGR基因c DNA序列,并对HMGR蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三级结构预测分析,并预测该蛋白功能;利用实时荧光定量PCR方法检测HMGR基因在接骨草的根状茎、地上茎、叶、花中的表达情况。结果克隆获得的HMGR基因c DNA全长为1 626 bp,编码593个氨基酸。生物信息学预测HMGR蛋白含2个跨膜区,不含信号肽。HMGR基因主要在接骨草的花和地上茎中表达较高,其他器官表达相对较低。结论首次从接骨草中克隆了HMGR基因,为进一步阐明该基因在接骨草萜类化合物代谢途径中的重要作用奠定基础。

联合调控对中国红豆杉细胞关键酶基因表达的影响

红豆杉悬浮培养细胞可以持续提供抗癌药物紫杉醇及一些紫杉烷类。在中国红豆杉悬浮培养细胞中,云南紫杉烷C(Tc)是主要的紫杉烷。为了更理性地调控紫杉醇或有用紫杉烷的生产,有必要深入了解其生物合成过程。采用实时定量PCR(Real-time Quantitative PCR,即RQPCR)技术考察经调控后紫杉醇及紫杉烷代谢中关键酶基因—TASY,T5αH,TDAT,T10βH,TαH,T14βH表达水平的变化。在细胞培养的第7天和12天,分别以100μmol/L2,3-二羟丙基茉莉酸(DHPJA)诱导,同时在细胞培养第7天进行20g/L蔗糖饲喂、100g/LXAD-7HP的原位吸附。该联合调控处理使得细胞培养第30天时,Tc产量高达1517±37mg/L,是对照处理的11.1倍,是DHPJA重复诱导联合蔗糖饲喂处理的1.7倍。RQ-PCR结果显示:DHPJA的加入可使6个基因表达水平显著提高,但在12小时后快速下降,需补充DHPJA以再次提高基因表达水平。吸附剂同时引入会延缓基因表达水平的提高速度,但却能维持基因表达处于一个较高的水平,表现为在细胞培养中后期,基因表达水平将显著高于无吸附剂的调控体系。与13α-羟化相对应的TαH基因有所不同,吸附剂的存在更显著地抑制其表达,但仍有维持表达的功能。

pN0期食管鳞癌血液微转移检测的临床意义

目的探讨pN0期食管鳞癌的血液微转移临床意义及其对预后的影响。方法提取血液标本总RNA，将mRNA反转录成cDNA，然后用实时荧光定量RT—PCR技术检测血液标本MMP-7 mRNA和hTERT mRNA表达，计算样本的△△Ct值，对40例N0期食管癌患者分别进行术后3、6、12个月跟踪随访复查。结果血液微转移与年龄、性别、癌肿长度等因素无相关关系，但与组织分化等级和pTNM分期间存在相关关系。随访结果显示单纯观察肿瘤不同侵犯深度与肿瘤术后转移（复发）率无相关性；随访术后6个月及12个月，血液微转移与否与肿瘤转移（复发）率有相关性（P〈0．05），其中血液微转移阳性患者术后12个月肿瘤转移（复发）概率是阴性患者的6．44倍（OR=6．440，95％CI为1．547～26．822）。结论食管鳞癌患者血液微转移检测对早期诊断及预后判断具有重要意义。

淋巴毒素β及其受体在变应性接触性皮炎小鼠皮肤中的表达

目的 检测淋巴毒素β及淋巴毒素β受体（LTβR）在变应性接触性皮炎（ACD）小鼠皮肤中的表达.方法 6～8周龄雌性BALB/c小鼠随机分为两组,实验组15只和对照组10只,实验组外用2,4-二硝基氟苯建立ACD模型,对照组不行任何处置,采用实时荧光定量PCR和免疫组化的方法分别检测ACD小鼠发生皮炎的耳廓皮肤和对照组小鼠耳廓皮肤中淋巴毒素β mRNA、LTβR mRNA及淋巴毒素β、LTβR蛋白的表达.结果 15只ACD小鼠组织标本淋巴毒素β及LT-βR mRNA相对含量中位数分别为3.630、1.148,其四分位间距分别为1.187、0.617;10只对照组组织标本淋巴毒素β及LTβR mRNA相对含量中位数都为1.000,其四分位间距都为0.000.经秩和检验两组间差异均有统计学意义（P＜0.01）.免疫组化结果显示,ACD小鼠中淋巴毒素β和LTβR表达明显升高,与对照组相比差异亦均有统计学意义（P＜0.01）.结论 变应性接触性皮炎小鼠皮损中淋巴毒素β及其受体mRNA相对含量升高,其蛋白表达明显升高.