MDR相关新基因CA916798真核表达载体的构建及其对H446细胞增殖的影响

目的构建新基因CA916798真核表达载体,并观察其对H446增殖的影响。方法以人A549细胞总RNA为模板,用RT-PCR技术扩增获得CA916798开放阅读框序列,连接入pBluescriptⅡSK克隆载体上,将重组质粒转化入大肠杆菌DH5α内并提取质粒,酶切与DNA测序鉴定准确,再用双酶切方法将CA916798开放阅读框序列定向连接到真核表达载体pQE-Trisystem中,构成pQE-Tri-CA916798,将pQE-Tri-CA916798转化入大肠杆菌DH5α内并提取质粒,双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确,脂质体转染人小细胞肺癌细胞系H446细胞,选取稳定转染不同质粒的H446细胞,采用MTT绘制细胞增殖曲线,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡率。结果扩增出CA916798开放阅读框序列,大小约为350bp,重组质粒的酶切鉴定结果与预期一致,测序结果完全正确。转染了pQE-Tri-CA916798的H446细胞顺铂作用后增殖速度加快,凋亡率下降。结论成功构建了pQE-Tri-CA916798真核表达质粒,并初步证实了其与顺铂诱导的肺癌多药耐药相关。

RNA干扰CA916798基因真核表达载体的构建与鉴定

目的构建CA916798基因RNA干扰(RNAi)的真核细胞表达载体。方法以CA916798为靶基因,以pGenSil-l质粒为载体,设计构建重组体,根据GenBank数据库提供的CA916798基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计2条带发夹结构的核苷酸序列,克隆到空载体pGenSil-l中,转化DH5α菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析。用脂质体2000将重组质粒转染A549/CDDP细胞并用G418筛选,MTT法测定药物敏感性并绘制细胞增殖曲线。结果构建针对CA916798的pRNAi-CA916798shRNA,经限制性内切酶酶切、PCR和DNA测序证实与设计完全一致;在荧光显微镜下观察到A549/CDDP细胞表达绿色荧光蛋白(GFP)证实重组质粒己转染入细胞并用G418剔除了未转染质粒的细胞,1.0μg/ml顺铂作用后pRNAi-CA916798shRNA转染组细胞增殖受到明显抑制(P<0.01)。结论成功构建CA916798基因的shRNA表达载体,并筛选出转染了CA916798shRNA的A549/CDDP细胞。

CA916798基因通过PI3K/AKT/mTOR通路参与顺铂耐药的机制分析

目的观察阻断PI3K/AKT/mTOR通路对人肺腺癌细胞A549及多药耐药人肺腺癌细胞A549/CDDP内CA916798基因mRNA表达的影响。方法以雷帕霉素、LY294002分别作用于人肺腺癌细胞A549和多药耐药人肺腺癌细胞A549/CDDP,检测顺铂作用后细胞生长及增殖情况,RT-PCR检测CA916798基因mRNA表达水平。结果以雷帕霉素和LY294002分别阻断A549、A549/CDDP细胞的PI3K/AKT/mTOR通路后,细胞对于顺铂的耐药性均显著下降(P<0.05),CA916798基因的表达均显著下调(P<0.05)。结论 CA916798基因位于PI3K/AKT/mTOR通路下游,可能是CA916798诱导肺癌顺铂耐药的机制之一。

CA916798基因通过PI3K/AKT通路参与肺癌顺铂耐药

目的在前期体外研究的基础上,建立裸鼠移植瘤模型,观察阻断PI3K/AKT通路对肺腺癌细胞A549及多药耐药肺腺癌细胞A549/CDDP内CA916798基因mRNA表达的影响。方法建立A549、A549/CDDP裸鼠移植瘤模型,以LY294002作用A549组和A549/CDDP组后,比较各组移植瘤生长情况,HE染色观察组织结构变化,实时荧光定量PCR检测肿瘤细胞中CA916798基因mRNA的表达水平。结果成功建立裸鼠移植瘤模型,以LY294002分别阻断A549、A549/CDDP组裸鼠移植瘤细胞的PI3K/AKT通路后,移植瘤体积明显缩小,CA916798基因的表达明显下调(P<0.05)。结论抑制PI3K/AKT通路能够明显抑制肺腺癌细胞A549及A549/CDDP的恶性增殖。

肺癌耐药相关基因CA916798核心启动子区域的初步鉴定

目的对肺癌耐药相关基因CA916798的核心启动子区域进行初步鉴定。方法采用PCR方法对CA916798基因上游不同长度的序列片段0H^9H进行扩增,以pGL3-basic载体构建基因报告质粒,转染COS7细胞,荧光素酶检测序列启动活性,酶切鉴定、测序及数据库比对确定核心启动子的可能存在位置,并采用生物信息学方法对核心启动子区域结合位点进行预测。结果成功构建了启动子荧光素酶报告基因;活性实验表明;9H组与阴性对照组比较,相对荧光强度差异具有统计学意义(P<0.05);0H^8H各组与9H组比较,相对荧光强度差异均具有统计学意义(P<0.05);9H片段为处于CA916798基因片段上游179 bp处,长度为568 bp的序列区;功能预测显示该区存在多种细胞因子的结合位点。结论 9H序列区域具有较强的启动活性,为基因CA916798的核心启动子序列区域。

CA916798基因在肺癌患者化疗前后肿瘤组织中的表达及其临床意义

目的研究耐药基因CA916798在肺癌患者化疗前后肿瘤组织中的表达及意义。方法收集2016年3-12月在我院行纤支镜活检、病理确诊的肺癌患者17例,采用实时定量PCR(qRT-PCR)以及免疫组化的方法分析肺癌组织中CA916798基因mRNA及蛋白在化疗前后的表达。结果 17例肺癌患者经过2个周期规范的前期化疗后,10例患者临床有效(病灶完全缓解或部分缓解),总体有效率为58.82%。化疗无效组CA916798基因mRNA表达显著高于化疗有效组(P<0.05);前期化疗前,化疗无效组和化疗有效组CA916798蛋白表达阳性率差异无统计学意义;前期化疗后,化疗无效组CA916798蛋白表达阳性率显著高于化疗有效组(P<0.05)。前期化疗后病灶稳定的患者中,再次化疗无效者,其CA916798基因表达在前期化疗后显著上调(P<0.05)。结论肺癌患者肿瘤组织中CA916798基因的表达变化与化疗效果相关,可能成为预测肺癌化疗敏感性的新的参考指标。