CACNA2D3在顺铂诱导HEI-OC1细胞凋亡中的作用及机制研究

目的探讨CACNA2D3在顺铂诱导的HEI-OC1细胞凋亡中的作用及机制。方法利用shRNA干扰技术敲减HEI-OC1细胞中CACNA2D3(sh-Cac3)表达,空白载体(sh-Vector)转染对照细胞,sh-Cac3细胞和sh-Vector细胞分别进行正常培养及顺铂干预。流式细胞术检测线粒体膜电位、凋亡情况、细胞内钙离子浓度;Western blot检测细胞凋亡相关蛋白(Bcl2、Cleaved-PARP1)和自噬标记蛋白LC3Ⅱ;免疫荧光法观察Tunel染色。结果正常培养下,CACNA2D3敲减会降低细胞内钙离子浓度(P<0.05),但不会影响细胞凋亡和自噬。顺铂干预下,相较于sh-Vector细胞,sh-Cac3细胞的线粒体膜电位降低程度更高(P<0.01);细胞凋亡率更高(9.41±0.66%vs 11.53±0.45%,P<0.01);Bcl2的表达显著降低(P<0.01),而Cleaved-PARP1的表达显著升高(P<0.01);Tunel染色阳性率更高(3.08±0.14%vs 6.40±0.43%,P<0.001)。此外,顺铂干预后sh-Cac3细胞的LC3Ⅱ的表达明显高于sh-Vector细胞(P<0.01)。结论CACNA2D3敲减通过调节钙相关自噬增强了顺铂诱导的HEI-OC1细胞凋亡;CACNA2D3的表达调控可能是顺铂耳毒性靶点治疗的新策略。

人CACNA2D3基因真核表达载体的构建及在食管鳞癌细胞中的表达

目的:构建电压依赖型钙离子通道基因CACNA2D3(calcium channel,voltage-dependent,alpha 2 delta subunit 3)真核表达载体,为进一步研究其在食管鳞癌发生发展中的作用打下基础。方法:利用RT-PCR技术扩增CACNA2D3基因编码序列,并将其克隆到真核表达载体pc DNA3.1(+)载体中,经双酶切和测序鉴定后转染到人食管癌细胞系EC109中,通过QRT-PCR技术检测CACNA2D3基因的表达情况。结果:从正常组织c DNA中扩增出CACNA2D3基因片段,大小与预期一致;得到的pc DNA3.1-CACNA2D3重组质粒通过双酶切和电泳后符合预期片段,进一步测序鉴定显示插入片段序列与Gen Bank中CACNA2D3的序列一致;重组质粒转染食管鳞癌细胞EC109后CACNA2D3基因在转录水平表达明显增高。结论:成功构建了pc DNA3.1-CACNA2D3重组质粒,并完成了在食管癌细胞EC109中的外源表达,为进一步研究其生物学功能奠定基础。