红毛藻多糖抑制大肠杆菌黏附Caco-2细胞的机制

基于体外人结肠腺癌细胞(Caco-2)单层模型,研究红毛藻多糖(Bangia fusco-purpurea polysaccharide,BFP)对大肠杆菌(Escherichia coli)黏附Caco-2细胞的影响以及潜在作用机制。采用CFDA-SE荧光标记技术分析BFP对E.coli黏附Caco-2细胞单层的影响;利用实时聚合酶链式反应分析BFP对Caco-2细胞表面整合素β1和E.coli黏附素fimH及E.coli黏附Caco-2细胞导致细胞产生的炎症因子(白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-8、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α)和细胞紧密连接蛋白(闭锁小带蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)与Occludin)的基因表达情况,最终基于Western Blot分析验证ZO-1、Occludin蛋白表达。结果表明,BFP在质量浓度为400~800μg/mL时能够显著抑制E.coli黏附Caco-2细胞单层;BFP主要通过下调Caco-2细胞表面整合素β1和E.coli黏附素基因fimH的表达抑制细菌的黏附。此外,BFP可显著抑制E.coli及其培养上清液诱导Caco-2细胞产生的炎症细胞因子基因表达的上调、紧密连接蛋白(ZO-1与Occludin)及其基因表达的下调。综上所述,BFP能够抑制E.coli对Caco-2细胞单层的黏附,实验结果可为其开发新型的抗菌产品以及BFP的高值利用和精深加工提供参考。

染料木素-川芎嗪共晶在Caco-2细胞模型中的转运研究

旨在考察染料木素(genistein,GEN)、川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)、染料木素-川芎嗪共晶(GEN-TMP)及染料木素与川芎嗪的物理混合物(GEN+TMP)在Caco-2细胞模型中的转运特征;建立Caco-2细胞模型,并以细胞跨膜电阻和标志物渗漏检查等指标进行验证,采用高效液相色谱法,考察并计算安全浓度下药物的累积转运量、表观渗透系数和外排率,并探讨P糖蛋白(P-gp)抑制剂维拉帕米、乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistant protein,BCRP)抑制剂KO143和多药耐药相关蛋白2(multidrug resistance-associated protein 2,MRP2)抑制剂MK571对转运的影响。结果显示,Caco-2细胞模型完整性与功能性良好,GEN浓度为40μg/mL时,GEN、TMP、GEN-TMP以及GEN+TMP的细胞存活率分别为90.06%、84.21%、97.60%和89.37%;GEN、TMP、GEN-TMP和GEN+TMP的表观渗透系数(P_(app))大于1.0×10^(-6)cm/s,属于吸收良好药物;GEN-TMP中GEN的累积转运量和P_(app)值分别为(2.78±0.11)μg和(8.61±0.33)×10^(-6)cm/s,比GEN的(1.92±0.15)μg和(5.96±0.47)×10^(-6)cm/s提高了44.79%和44.46%;GEN+TMP中GEN的累积转运量和P_(app)值与GEN无显著性差异。GEN只受BCRP的外排作用,GEN-TMP中的GEN同时受到P-gp和BCRP的外排作用,TMP、GEN-TMP和GEN+TMP中的TMP均受到MRP2的外排作用。结果表明,相同浓度下,GEN-TMP的细胞存活率高于GEN+TMP。GEN-TMP的吸收强于GEN和GEN+TMP中的GEN,共晶受外排蛋白的作用区别于GEN和GEN+TMP中的GEN,研究工作为共晶的转运研究提供了借鉴和参考。

羊血红蛋白水解物中新型抗氧化肽的纯化、鉴定和对H_(2)O_(2)损伤Caco-2细胞保护作用

以新鲜羊血为原料制备羊血红蛋白抗氧化肽,采用葡萄糖凝胶G-25色谱、DEAE葡萄糖凝胶A-50阴离子交换色谱、反相高效液相色谱和液相色谱-串联质谱对羊血红蛋白水解物进行分离纯化和鉴定,通过研究自由基清除能力、模拟胃肠消化后的稳定性及对H2O2诱导的Caco-2细胞保护作用评价羊血红蛋白肽的抗氧化活性。结果表明,从羊血红蛋白粗肽中纯化并鉴定出Ala-Tyr-Glu-Val-Asp(AYEVD)、Phe-His-Thr-Met-Glu(FHTME)、Ser-PheMet-Tyr-Glu-Lys(SFMYEK)3种新型抗氧化活性肽,分子质量分别为595.60、663.74、803.92 Da;其中AYEVD的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除能力最强;AYEVD在模拟胃肠道消化后显示出更强的抗氧化活性。此外,AYEVD还能抑制H2O2诱导Caco-2细胞的氧化损伤,显著减少活性氧积累、抑制早期细胞凋亡和丙二醛的形成,并提高细胞内抗氧化酶活性。该研究可为羊血红蛋白肽作为新型抗氧化剂应用于功能食品提供理论依据。

猕猴桃皮多酚对脂多糖应激Caco-2细胞抗氧化能力的影响

目的:探讨猕猴桃皮多酚(kiwifruit peel polyphenols,KPP)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)应激Caco-2细胞抗氧化能力的影响。方法:采用CCK-8法测定不同处理组Caco-2的细胞活力,荧光分光光度计测定活性氧和线粒体膜电位,分光光度计测定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力和谷胱甘肽(glutathione,GSH)、丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量,实时荧光定量聚合酶链式反应测定核红细胞2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)、Kelch样ECH相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)、NAD(P)H:醌氧化还原酶1(NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1,NQO1)、超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1,S O D 1)、S O D 2基因的表达;蛋白印迹测定N r f 2、Ke a p 1及N Q O 1蛋白表达水平。结果:与L P S组相比,经50μg/mL KPP干预后细胞活力显著升高(P<0.05);活性氧水平和MDA含量分别显著下降至1.82±0.28、5.08 nmol/mg(P<0.05),线粒体膜电位显著升高至1.84±0.10(P<0.05),SOD活力和GSH含量分别显著升高至52.57 U/mg和69.46μmol/g(P<0.05);同时KPP干预能显著提高Nrf2、NQO1基因和蛋白表达(P<0.05),显著降低Keap1基因和蛋白表达(P<0.05)。结论:KPP能够通过Keap1/Nrf2/NQO1信号通路提高Caco-2的抗氧化水平,缓解LPS应激造成的细胞损伤。

基于Caco-2细胞模型的辣椒素与槲皮素协同调节小肠糖代谢的分子机制

为探究辣椒素与槲皮素协同调节小肠糖代谢的分子机制,借助Caco-2细胞单层模型,研究辣椒素与槲皮素单一及联合处理对Caco-2细胞存活率、细胞膜通透性的影响。采用免疫印迹法测定跨膜蛋白Occludin、胞质蛋白ZO-1、表面生长因子受体EGFR和纤维状肌蛋白F-actin以及葡萄糖转运关键蛋白GLUT2、SGLT1、Na^(+)/K^(+)-ATPase的表达量。结果显示:各试验处理组Caco-2细胞的增殖率均大于75%,表明药物对细胞没有明显毒性,可进行后续试验。Caco-2细胞单层模型的跨膜电阻值为(315.70±26.65)Ω·cm^(2),加药后各试验组的跨膜电阻值均呈现上升趋势,表明膜通透性变小,细胞屏障功能增强,可延缓小肠对葡萄糖的吸收。同时与空白对照组相比,各试验组上调了跨膜蛋白Occludin(>0.65)、胞质蛋白ZO-1 (>0.51)、表面生长因子受体EGFR(>0.19)和纤维状肌蛋白F-actin(>0.04)的相对表达量,并且下调了葡萄糖转运关键蛋白GLUT2(>1.00)、SGLT1(>0.78)、Na^(+)/K^(+)-ATPase(>0.87)的相对表达水平。综合来看,辣椒素与槲皮素在调节小肠糖代谢方面具有协同效应,二者在高剂量水平以1∶3比例混合效果最佳,主要通过增强肠道黏膜屏障功能,下调葡萄糖转运关键蛋白水平,从而抑制小肠对葡萄糖的吸收来达到调节糖代谢的效果。

Caco-2细胞单层缺氧再复氧损伤的模型构建

目的构建Caco-2细胞单层缺糖、缺血清、缺氧,再复糖、复血清、复氧的损伤模型,探究一氧化碳释放分子3(CORM-3)对Caco-2细胞单层缺氧再复氧损伤模型的影响。方法首先,培养Caco-2细胞,于37℃、含5%CO_(2)、1%O_(2)与94%N_(2)的培养箱中缺氧,建立Caco-2细胞单层缺糖、缺血清、缺氧/复糖、复血清、复氧(H/R)模型。根据缺氧时间分4组,空白对照组(Control组)、H/R 1组(缺氧4 h、复氧4 h)、H/R 2组(缺氧8h、复氧4h)和H/R 3组(缺氧12 h、复氧4 h)。其次,溶解CORM-3药物粉末并制备无活性的CORM-3(iCORM-3),按药物浓度分6组,空白对照组(Control组)、缺氧、复氧损伤模型组(H/R组)、H/R+300μmol/L CORM-3(H/R+C1组)、H/R+400μmol/L CORM-3(H/R+C2组)、H/R+500μmol/L CORM-3(H/R+C3组)和H/R+500μmol/L iCORM-3(H/R+C4组)。主要采用Cell counting kit-8(CCK8)试剂盒检测细胞活力,倒置显微镜观察细胞形态变化,测定Caco-2细胞单层渗透性。结果随着缺氧时间的延长,可观察到Caco-2细胞间连接消失,细胞皱缩从培养瓶底脱落漂浮,细胞活力下降,细胞单层通透性增大。给予CORM-3药物干预处理后,相比于未干预损伤组Caco-2细胞均有不同程度的改善,细胞活力随着药物浓度的增加而上升。结论本研究成功构建Caco-2细胞单层缺氧再复氧的损伤模型,并发现CORM-3对Caco-2细胞单层H/R损伤模型可能有保护作用。

人参皂苷对过氧化氢诱导的Caco-2细胞氧化损伤的保护作用

为研究人参皂苷对H_(2)O_(2)诱导的人结肠癌(Caco-2)细胞氧化应激损伤的保护作用,构建H_(2)O_(2)诱导的Caco-2细胞氧化损伤模型,以不同质量浓度(10、20、50μg/mL)的人参皂苷干预H_(2)O_(2)诱导后的Caco-2细胞,通过形态学观察,CCK-8法检测细胞活力,测定胞内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)水平,测定氧化损伤标志物丙二醛(malondialdehyde,MDA)活力以及活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,评价人参皂苷的抗氧化应激水平。结果表明,200μmol/L的H_(2)O_(2)诱导Caco-2细胞4 h后,细胞存活率达到58%左右,符合建模要求。添加10~50μg/mL的人参皂苷明显提升受损细胞的存活率、SOD以及胞内GSH-Px活性,降低受损细胞内ROS和MDA水平,对H_(2)O_(2)诱导的Caco-2细胞氧化应激损伤起到良好的保护作用。

聚苯乙烯纳塑料诱导Caco-2细胞氧化应激和线粒体损伤的研究

微/纳米塑料的潜在毒理效应及健康风险引起广泛关注。本研究以人结直肠腺癌细胞(Caco-2)为模型,研究聚苯乙烯纳米塑料(polystyrene nanoparticles,PS-NPs)的细胞毒性,从氧化应激和线粒体损伤角度探讨PS-NPs肠道毒性机制。结果表明PS-NPs暴露导致细胞形态改变,细胞活力下降,乳酸脱氢酶释放增加,确定其最低效应浓度是50μg·mL-1。随着PS-NPs暴露浓度增加,细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量和丙二醛水平升高,线粒体膜电位水平降低、Ca^(2+)超载、线粒体膜通透性转换孔开放、二磷酸腺苷/三磷酸腺苷比率(ADP/ATP)上升,最终细胞凋亡率增加。PS-NPs暴露浓度为200μg·mL-1时,ROS含量升高至对照组的3.85倍;线粒体去极化程度降低至对照组的0.63倍;细胞凋亡率达到28.90%(P<0.01)。PS-NPs通过诱导细胞ROS生成,产生氧化应激,过量的ROS会对线粒体造成损伤,最终导致细胞凋亡率升高,因此氧化应激和线粒体损伤是PS-NPs引起细胞毒性的关键机制。本研究结果将为PS-NPs的肠道毒理效应和健康风险评估提供基础数据和科学依据。

牡蛎锌结合肽的稳定性及其跨Caco-2细胞模型的吸收转运机制

【目的】探究香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)锌结合肽(ZnPE)在热环境、酸碱环境中的稳定性及跨Caco-2细胞模型的吸收转运机制,为锌补剂开发提供理论依据。【方法】以牡蛎锌螯合肽(Zn-PE)和ZnSO4为对照,以总锌、锌离子的溶解率为评价指标,在40、50、60、70和80℃以及pH值为2、4、6、8、10条件下,研究ZnPE的热稳定性和酸碱稳定性;并建立Caco-2细胞模型,研究ZnPE在跨Caco-2细胞模型的吸收率、生物利用率和转运途径;通过液质联用法研究ZnPE跨Caco-2细胞模型后的序列变化。【结果】不同温度中ZnPE与Zn-PE的总锌、锌离子溶解率无显著差异(P>0.05),两者均可保持较高的稳定性。在酸性环境(pH=2)中,ZnPE和Zn-PE中总锌溶解率均在90%以上,而锌离子有一定程度的释放,溶解率分别为22.30%、33.45%,两者稳定程度降低,但ZnPE稳定性显著高于Zn-PE(P<0.05)。在碱性环境(pH=8)中,ZnPE和Zn-PE均保持稳定。ZnPE可完整、稳定的通过Caco-2细胞模型,且其锌的吸收率为74.37%、生物利用率为76.40%,显著高于Zn-PE、ZnSO_(4)(P<0.05)。ZnPE中的锌主要以肽的形式通过细胞旁路和转胞吞作用的方式跨Caco-2细胞模型转运。转运后鉴定出8种锌结合肽,其中的5种和转运前一致,表明ZnPE在吸收转运中可保持较高的稳定性。【结论】ZnPE可在热环境、酸碱环境中及跨Caco-2细胞模型转运时保持较高的稳定性。

黄芪多糖脂质体的制备及其在Caco-2细胞模型的转运特性研究

【目的】研究黄芪多糖脂质体(Astragalus polysaccharide liposomes,APSL)制备及其在Caco-2细胞模型中的转运。【方法】采用薄膜分散法制备APSL,通过透射电镜观察APSL结构,鱼精蛋白法检测APSL的包封率及载药量;建立Caco-2单层细胞模型,通过透射电镜观察其结构,测量细胞电阻值及荧光素钠表观渗透系数(apparent permeability coefficient,Papp)来评价Caco-2细胞模型的致密性和完整性;分别进行肠腔侧(apical side,AP)到基底侧(basolateral side,BL)及BL到AP侧两个转运方向的跨膜转运试验,分析药物浓度及P-糖蛋白(P-gp)的抑制剂维拉帕米溶液(Verapamil,Ver)对转运的影响。【结果】APSL包封率为71.74%±4.87%,载药量为2.92%,透射电镜下可见球状双层结构,粒径为(126.6±0.283)nm(n=3),聚合物分散性指数(polymer dispersity index,PDI)为0.190±0.009;透射电镜下观察Caco-2细胞紧密结合,形成微绒毛结构,跨膜电阻值达到650Ω·cm^(2),碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)比值达到3.05,荧光素钠Papp为1.96×10^(-7)cm/s,可满足转运试验的要求。在不同浓度下(75、150、300μg/mL),黄芪多糖(APS)的外排率(efflux ratio,ER)均>1.5,APSL的ER均<1.5。3个浓度上AP-BL吸收方向上APSL组Papp均极显著高于APS组(P<0.01),且ER均低于APS组。加入P-gp蛋白抑制剂后,与APS组相比,APS+Ver组AP-BL方向Papp极显著升高(P<0.01),ER降低;而APSL+Ver组两侧的Papp均没有明显变化(P>0.05)。与APS组ER(3.995)相比,APSL组的ER(1.005)降低。【结论】APS在体外Caco-2细胞单层模型上的转运较差,为低渗透性化合物,可能存在P-gp蛋白外排,而APSL能够增加APS的转运吸收,提高药物渗透性。

笛鲷鱼鳞源功能多肽对Caco-2细胞氧化应激损伤的保护作用

本实验利用650μmol/L H_(2)O_(2)构建Caco-2细胞氧化应激损伤模型,探究笛鲷鱼鳞源功能多肽(crimson snapper scale peptides,CSSPs)对Caco-2细胞氧化应激损伤的保护作用。通过测定细胞上清液乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活力和白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)质量浓度、胞内抗氧化酶活力和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量、胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)相对含量、相关凋亡基因(Caspase-3、Caspase-9、Bax和Bcl-2)的相对表达量,从细胞氧化还原状态和细胞凋亡两方面阐明CSSPs对损伤Caco-2细胞的抗氧化作用。结果显示,CSSPs能够通过抗氧化防御系统来减轻H_(2)O_(2)对Caco-2细胞的损伤,主要包括增加胞内抗氧化酶活性以抑制LDH释放、胞内ROS积累、MDA及IL-8的生成。此外,CSSPs抑制氧化应激损伤诱导的细胞凋亡与线粒体介导的细胞凋亡途径有关,其可显著提高线粒体膜电位,下调Caspase-3、Caspase-9和Bax表达,上调Bcl-2表达。结果表明,CSSPs能够维持细胞氧化还原稳态和抑制细胞凋亡,有效减轻Caco-2细胞的损伤程度。

黄芩汤含药血清对TNF-α诱导的Caco-2细胞炎症模型的影响

目的:观察黄芩汤不同时间点的含药血清对TNF-α诱导的Caco-2细胞炎症模型的影响。方法:参照《伤寒论》组方及课题组的前期研究,煎煮、过滤、浓缩制成黄芩汤提取物,按照20 g/kg的剂量一次性给予大鼠黄芩汤,分别于给药后0、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24 h眼眶取血,分离血清,MTT法观察不同浓度的黄芩汤含药血清对Caco-2细胞增殖的影响;并用TNF-α诱导细胞炎症损伤模型,10%的含药血清给药18 h后,采用Griess法观察黄芩汤含药血清对其NO的影响,采用Elisa法测定IL-1β、PGE_(2)和TNF-α的变化。结果:与正常组相比,5%、10%、20%的黄芩汤含药血清作用Caco-2后,均有促进其增殖的作用,尤以10%黄芩汤含药血清的效果最佳;10 ng/mL的TNF-α致炎效果最佳;不同时间点的10%黄芩汤含药血清可降低炎症细胞内NO的含量,降低细胞内IL-1β、TNF-α和PGE_(2)的浓度。结论:黄芩汤不同时间点的含药血清对TNF-α诱导的Caco-2细胞炎症具有明显的抑制作用,其作用机制可能与抑制NO、IL-1β、TNF-α等炎性因子有关。

卵黄高磷蛋白磷酸肽在Caco-2细胞单层模型中的促钙转运作用

结合高温低压处理、胰蛋白酶和嗜热菌蛋白酶复合酶解制备具有高钙结合能力的卵黄高磷蛋白磷酸肽(Phosvitin phosphopeptides,PPP)。通过优化确定制备PPP-Ca的最佳条件为pH 9.5,多肽与钙质量比7∶1,此条件下钙螯合率达到97%,PPP-Ca在模拟胃肠道消化中显示了极高的稳定性。使用Caco-2细胞单层模型验证PPP-Ca在体外的钙转运作用,通过细胞形态、电阻值和荧光素钠透过率等验证Caco-2细胞模型,毒性实验(MTT)结果显示PPP-Ca对Caco-2细胞呈现低毒性作用。研究PPP-Ca和PPP对Caco-2细胞转运钙离子质量浓度和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)活性的影响,采用RT-PCR测定Calbindin D9K mRNA的相对表达量。结果表明,PPP和PPP-Ca能够显著提高AKP活性,钙转运量从(3.06±0.08)μg增到(5.66±0.62)μg,Calbindin D9K mRNA的表达量增加2倍,进而增强人体肠道中钙的转运吸收。研究结果为开发新的钙补充剂和卵黄高磷蛋白提供了科学证据。

菌草灵芝多糖肽对Caco-2细胞MDR1、MRP2基因表达水平的影响

使用CCK-8比色法研究菌草灵芝多糖肽(JCGLPP)对人结肠腺癌上皮细胞(Caco-2)存活率的影响;采用PCR检测JCGLPP作用不同时间后对Caco-2细胞中P-糖蛋白的编码基因MDR1和多药耐药相关蛋白-2的编码基因MRP2表达水平的影响.结果显示:0.1~500μg·mL^(-1)JCGLPP对Caco-2细胞无毒性;10μg·mL^(-1)JCGLPP作用1~48 h能抑制MDR1基因的表达,对MRP2基因的表达呈先抑后扬的趋势.表明JCGLPP可抑制MDR1基因的表达,对MRP2基因表达的影响与其作用时间有关.

低氧对Caco-2细胞P-gp表达及功能的影响

目的:低氧会改变许多药物的口服生物利用度,其中也包括多种P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的底物(药物),提示低氧可能影响肠上皮细胞P-gp的功能。Caco-2细胞单层膜模型是当前研究肠上皮P-gp功能的经典模型。本研究通过结合Caco-2细胞单层膜模型与低氧处理,研究低氧对Caco-2细胞P-gp表达和功能的影响,有助于阐明高原低氧环境改变肠上皮药物转运的机制。方法:正常培养的Caco-2细胞在1%的O_(2)浓度条件下分别培养24、48、72 h,提取膜蛋白后,采用蛋白质印迹法检测P-gp的表达水平,选择表达变化最显著的缺氧时间用于后续研究。于transwell小室中培养Caco-2细胞21 d,建立Caco-2细胞单层膜模型后,将其分为常氧对照组与低氧组,常氧对照组以正常条件继续培养72 h,低氧组在1%的O_(2)浓度条件下继续培养72 h,通过跨膜电阻(transepithelial electrical resistance,TEER)、荧光黄表观渗透系数(apparent permeability coefficient,Papp)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)活性及透射电镜下观察微绒毛与紧密连接结构,评价Caco-2细胞单层膜的完整性和极化状态。采用双向转运实验检测P-gp特异性底物罗丹明123(rhodamine 123,Rh123)的Papp,计算外排率。将Caco-2细胞在塑料培养瓶中连续培养21 d形成Caco-2细胞单层膜,在1%O_(2)浓度条件下处理72 h后,采用蛋白质印迹法检测膜蛋白中P-gp的表达水平。结果:1%的O_(2)浓度处理下调Caco-2细胞P-gp的表达,其中处理72 h下调最为显著(P<0.01);低氧组Caco-2细胞单层膜TEER大于400Ω·cm^(2),荧光黄Papp小于5×10^(-7)cm/s,肠腔侧与基底侧AKP活性比值大于3。表明Caco-2细胞单层膜模型建立成功,且低氧处理未影响模型的完整性与极化状态。与常氧对照组相比,低氧组Caco-2细胞单层膜Rh123的外排率显著降低(P<0.01);1%的O_(2)浓度培养72 h,下调Caco-2细胞单层膜P-gp的表达(P<0.01)。结论:低氧抑制Caco-2细胞P-gp功能,其可能与P-gp表达水平降低有关。

莱柯霉素在Caco-2细胞单层模型中的转运特性研究

【目的】研究莱柯霉素在Caco-2细胞单层模型中的转运特性,为进一步深入了解莱柯霉素在体内的吸收过程提供试验依据。【方法】建立Caco-2细胞单层模型,通过测定跨膜电阻(TEER)值、低渗透性药物荧光素钠通透性试验的表观渗透率Papp(AP-BL)来验证Caco-2细胞单层模型的致密性并进行模型筛选。考察在Caco-2细胞单层模型中莱柯霉素从顶侧(apical side,AP)到基底侧(basolateral side,BL)及基底侧到顶侧的转运特性,分析药物浓度、pH及外排转运蛋白(P-gp、MRP2和BCRP)抑制剂3种因素对莱柯霉素转运的影响。用超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)法检测药物浓度,计算其表观渗透率和外排率。【结果】连续20 d的跨膜电阻值检测及荧光素钠通透性试验显示,随培养时间增加,Caco-2细胞单层模型的跨膜电阻值逐渐增加,在20 d时达到400Ω·cm 2左右;荧光素钠在0.1~6μg/mL内线性关系良好(R^(2)=0.991),计算荧光素钠AP侧向BL侧的表现渗透率(Papp(AP-BL))为(1.57×10^(-7)±9.92×10^(-9))cm/s,小于试验规定的0.5×10^(-6) cm/s,表明Caco-2细胞单层模型建立成功,可用于莱柯霉素的转运特性研究。莱柯霉素Papp(AP-BL)值随时间无明显变化且水平较低,而BL侧向AP侧的表现渗透率(Papp(BL-AP))值随时间递增,在孵育120 min时达到最高水平(2.0350×10^(-6) cm/s),表明肠道外排莱柯霉素的能力较强。随莱柯霉素浓度递增,Papp(BL-AP)值呈上升趋势,具有浓度依赖性。当溶液pH为8.0时,Papp(BL-AP)值(39.3871×10^(-6) cm/s)明显高于pH为6.5和7.4的溶液,表明碱性环境可加速莱柯霉素外排。维拉帕米、丙磺舒和GF1209183种转运蛋白抑制剂均能显著抑制莱柯霉素由BL侧向AP侧的转运,外排率均>1.5,可能有外排蛋白参与转运。【结论】莱柯霉素在体外Caco-2细胞单层模型上的转运较差,吸收率低,表现为低渗透性化合物;随着浓度和pH的升高,莱柯霉素外排增强;外排转运蛋白P-gp、MRP2及BCRP可能参与莱柯霉素转运过程。

基于UPLC-TQ-MS探究野鸦椿酸在Caco-2细胞单层模型上的吸收转运研究

目的本研究建立Caco-2单层细胞模型研究野鸦椿酸摄取和转运特性。方法采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪(UPLC-TQ-MS)测定野鸦椿酸的含量,考察不同时间、温度对其摄取的影响,在此基础上考察不同浓度、P-gp抑制剂、螯合剂和pH对其双向转运的影响。结果在37℃条件下,野鸦椿酸在Caco-2细胞模型上180 min时的摄取量为(8.38±0.87)μg/mg。野鸦椿酸低、中、高浓度的表观渗透系数(Papp值)与浓度呈正相关,分别为(61.41±2.92)×10^(-4)、(146.90±14.91)×10^(-4)、(167.18±6.72)×10^(-4)cm/s,P-gp抑制剂和螯合剂对其Papp值无影响,弱酸性环境(pH=6.00)可明显提高其Papp值,其外排率(ER)介于0.8~1.4之间。结论在Caco-2细胞模型中野鸦椿酸跨膜渗透性良好,其主要吸收方式为被动扩散,不是P-gp的底物,且不存在细胞旁路转运。本研究可为含有野鸦椿酸的药物的体内肠道吸收提供实验依据。

越橘花青素脂质体对Caco-2细胞的抗氧化作用

目的:研究越橘花青素脂质体对氧化应激状态下Caco-2细胞抗氧化功能的影响。方法:以大豆卵磷脂和胆固醇混合物为壁材,采用薄膜分散法制备越橘花青素脂质体,并对其稳定性进行评估。通过建立过氧化氢诱导的Caco-2细胞氧化损伤模型,评估越橘花青素脂质体对氧化损伤细胞的保护效果。结果:越橘花青素脂质体呈表面光滑的球型结构,平均粒径(213.2±13.4)nm,多分散性指数(PDI)0.201±0.026。随着储存时间的延长,花青素脂质体的粒径和pH值逐渐增大。在质量浓度均为200μg/mL时,花青素组与花青素脂质体组的氧化损伤细胞生存率分别为74.33%和84.17%;氧化损伤细胞内ROS含量分别下降了36.58%,38.02%;MDA含量分别下降了43.44%,53.66%;T-AOC含量分别提高了3.42,8.89倍;SOD酶活性分别提高了5.76%,8.79%;CAT酶活性分别提高了9.21%,12.26%。结论:脂质体作为载体可以提高越橘花青素的生物活性。越橘花青素脂质体可以降低受损细胞内MDA与ROS水平,提高氧化损伤细胞的生存率,增强细胞内源性抗氧化酶的活力,进而发挥抗氧化作用。

三种角型吡喃香豆素在Caco-2细胞模型中的吸收转运

邪蒿素、5-甲氧基邪蒿素和5-羟基邪蒿内酯是一类具有角型苯并吡喃香豆素骨架结构的天然产物,具有抗炎、抗菌、抗病毒、镇痛、抗肿瘤等多种药理作用[1–4],其中邪蒿素具有较强的抗病毒作用,尤其是对SARS-COV-2的多个靶点有抑制活性[5]。目前,有关3种香豆素的吸收报道甚少,而胃肠道的吸收是口服药物产生体内活性的先决条件。Caco-2细胞单层模型是目前最常用的体外肠吸收模型[6–7],本研究采用该模型模拟3种香豆素的跨膜转运,同时结合时间、浓度、温度、维拉帕米和脂溶性对跨膜转运特性的影响分析,阐释3种香豆素的肠吸收特性,为其进一步开发利用提供依据。

细胞代次对t-BHP诱导Caco-2细胞构建氧化应激模型的影响

目的:探究细胞代次对叔丁基过氧化氢(t-BHP)诱导构建人克隆结肠腺癌细胞(Caco-2)氧化应激模型的影响。方法:以不同浓度t-BHP(1、2和3 mmol/L)处理第F15代Caco-2细胞1、2、3、4、5和6 h后测定不同处理下细胞丙二醛(MDA)和8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)的含量,以确定构建Caco-2细胞氧化应激模型的基础条件。再以8-OHdG为分子标志物,探究细胞代次(F14、F15、F18、F19和F20)对Caco-2细胞氧化应激模型构建的影响。结果:采用1、2和3 mmol/L t-BHP处理F15代Caco-2细胞3~6 h均可稳定构建氧化应激模型。当以2.0 mmol/L t-BHP处理不同代次Caco-2细胞5 h后,F14、F15和F18代细胞的8-OHdG浓度均显著高于对照(P<0.05),而F19和F20代细胞的8-OHdG浓度与对照无显著差异。结论:Caco-2细胞代次会影响其氧化应激模型的构建,F19代之前的Caco-2细胞采用2 mmol/L t-BHP处理细胞5 h可稳定构建氧化应激模型。