棉花CAD基因家族的生物信息学分析

苯丙烷代谢是植物重要的次生代谢途径之一,其代谢产物在植物的生长发育中发挥着重要作用。肉桂酸脱氢酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD)是苯丙烷代谢途径的关键酶之一,在棉花纤维品质形成中起着十分重要的调节作用。为了更好地了解CAD基因家族在二倍体雷蒙德氏棉(D5)和亚洲棉(A2)、四倍体陆地棉(AD1)和海岛棉(AD2)基因组中的数量和分布情况,通过生物信息学方法,在雷蒙德氏棉、亚洲棉、陆地棉和海岛棉全基因组中分别鉴定出16、16、28和25个CAD基因家族成员,进一步分析了这些CAD家族成员进行基因结构、染色体定位、保守域、进化关系及CAD基因在陆地棉不同器官组织中的表达等。结果表明,4个棉种全基因组分别编码16、16、28和25个CAD基因。亚细胞定位将这些棉花CAD基因的表达产物均定位于细胞质。雷蒙德氏棉有14个CAD成员基因分布在5条染色体上,亚洲棉有13个CAD成员基因分布在5条染色体上,陆地棉28个CAD成员基因、海岛棉25个CAD基因分别分布在10条染色体上;内含子/外显子结构分析表明,CAD基因结构较为复杂,均含有内含子和外显子;功能结构域分析发现,有棉花CAD蛋白具有高度保守的ADH_N和ADH_zinc_N 2个功能域;根据系统发育分析结果,将CAD基因家族分成3个亚类。大部分CAD基因在陆地棉的不同器官中均有表达,部分在棉花纤维中表达量较高。分析结果为进一步研究棉花CAD基因家族各成员的功能奠定了理论基础。

转抗菌肽CAD基因酵母饲料添加剂的安全性评价

目的 通过对转抗菌肽CAD基因酵母饲料添加剂的安全性评价 ,研究和建立转基因饲料安全性的评价模型和检验方法。方法 通过对受体生物和外源基因表达产物的安全性 ,转基因酵母生物性状的遗传稳定性 ,抗菌杂合多肽基因及产物在环境和饲养动物体内的转移和蓄积等进行检验和评价 ,确认产品的安全性。结果及结论 转抗菌肽CAD基因酵母饲料的受体生物、外源基因表达产物是安全的 ,产品具有稳定的遗传性状 ,抗菌杂合肽CAD在饲养动物体内不蓄积 ,抗菌肽CAD基因不向其他微生物转移 。

陆地棉CAD基因家族的进化和表达分析

【目的】对陆地棉CAD基因家族成员进行进化和表达分析,了解其在棉纤维发育中的作用。【方法】应用生物信息学方法,从棉花基因组中筛选出21个CAD基因,并对CAD的基因结构、染色体分布、基因倍增模式以及系统进化进行分析。利用深度表达数据分析CAD基因在棉纤维发育各时期的表达。对比观察拟南芥cad5突变体和野生型根毛表型。【结果】同源性高的CAD基因复制对之间有相似的基因结构;片段重复和串联重复是CAD基因扩增的主要方式。进化分析可知,CAD基因可分为七个亚组,且功能相近的基因聚类在相同亚组。利用深度测序表达数据分析可知,CAD基因在棉纤维各个发育时期均有表达。对比拟南芥cad5突变体和野生型根毛发现,突变体相比于野生型有更长的根毛。【结论】CAD基因参与了棉纤维的发育的过程,并对棉花纤维发育起到一定的调控作用。

亚麻CAD基因克隆及序列分析

以亚麻(Linum usitatissimum L.)为材料,研究木质素代谢的关键酶亚麻肉桂醇脱氢酶基因序列。分离了高纯度的RNA,以RNA为模板,用简并引物以RT-PCR的方法,克隆了亚麻CAD基因cDNA部分序列,长度为477bp,编码159个氨基酸残基。此cDNA序列为亚麻CAD基因序列。

榅桲果实CAD基因的克隆、序列分析及表达

【目的】研究榅桲果实木质化与CAD基因的关系。【方法】基于GenBank报道的近缘物种CAD基因cDNA序列,应用Primer Premier 5.0软件设计PCR扩增引物。提取榅桲总RNA,经反转录后合成cDNA,应用RT-PCR方法成功扩增出CAD基因片段并克隆到pMD18-T载体。通过DNAstar软件进行同源序列比对,ClustalX结合MEGA4.1软件构建系统进化树,采用Protparam在线程序分析蛋白质的理化性质,用DNAstar的Protean程序预测二级结构。通过间苯二酚染色鉴定果肉发育时期木质素的积累程度,并利用RT-qPCR对CAD基因在发育期时期的表达规律进行检测。【结果】榅桲CAD基因其开放阅读框(ORF)序列为1 071 bp,编码356个氨基酸,与其他物种序列同源性最高达96%,进化关系上与苹果较近。在果实6个发育时期,木质素积累逐渐降低,而CAD基因表达与果实木质化程度紧密相关,随着木质素合成趋缓呈现一个逐步下调的趋势。【结论】CAD基因是调控榅桲果实木质化的关键基因。

Cad-Ⅱ基因转染的hMSCs在异种骨基质材料上的粘附和增殖研究

目的探讨经Cad-Ⅱ(OB-Cadherin,成骨细胞特异性钙粘蛋白)基因转染的人骨髓间充质干细胞(humanmarrow mesenchymal stem cells,hMSCs)在骨基质材料上的粘附性和增殖情况。方法将脂质体介导的Cad-ⅡcDNA转染体外分离培养的hMSCs,再将已转染和未转染的hMSCs分为实验组和对照组,分别与异种冻干脱钙骨基质材料复合体外构建组织工程骨,通过相差显微镜、扫描电镜及MTT检测对比观察两组细胞在材料上的黏附和增殖情况。结果2组细胞均能在骨基质材料上粘附、伸展、增殖,其中增殖情况无明显差异(P>0.05),但Cad-Ⅱ基因转染组的上架细胞数和上架率(84.5%),显著高于未转染组(71.7%),差异显著(P<0.05)。结论Cad-Ⅱ基因转染能提高种子细胞在支架材料上的粘附性,但对细胞增殖无影响。

亚麻CAD基因克隆及反义表达载体的构建

本试验以亚麻(Linum usitatissimumL.)品种Argos为材料,分离了高纯度的RNA。用简并引物以RT-PCR的方法,克隆了亚麻CAD基因cDNA部分序列,长度为477bp,构建了pGEM-T-CAD质粒。用限制性内切酶EcoRI酶切pGEM-T-CAD质粒和载体pGEM-7Zf(-),进行连接,构建成中间表达载体pGEM-7Zf(-)-CAD质粒。用限制性内切酶XbaI和BamHI双酶切中间表达载体pGEM-7Zf(-)-CAD质粒和pBI121载体,进行连接,构建了亚麻CAD基因反义植物表达载体pBI121-antiNTCAD。

子宫内膜癌中p16、E-cad mRNA表达的研究

目的 :探讨p16及E 钙粘附蛋白 (E cad)基因mRNA在子宫内膜癌中的表达及意义。方法 :采用RT PCR技术检测 3 0例子宫内膜癌及 8例正常子宫内膜组织的p16及E cadmRNA的表达。结果 :①子宫内膜癌p16mRNA的阳性表达明显低于正常子宫内膜 (P <0 .0 1) ,但p16mRNA的表达与子宫内膜癌的组织病理分级无关 ;②E cadmRNA在子宫内膜癌中呈低表达 ,正常组织内呈强阳性表达 ,二者差异非常显著 (P <0 .0 1) ,并且在子宫内膜癌中E cadmRNA的阳性表达与组织病理学分级呈负相关 (P <0 .0 5 )。结论 :p16、E

大鼠脑缺血再灌注后半暗带CAD基因的表达改变

目的 探讨大鼠局灶性脑缺血再灌注后缺血半暗带Caspase 3激活的DNA酶 (CAD)基因的表达变化规律。方法 线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞 (MCAO)及再通模型。应用RT PCR技术检测MCAO再通后不同时相缺血半暗带皮质CAD基因的表达。结果 脑缺血再灌注 6h ,缺血半暗带皮质CADmRNA显著升高 ,密度比值为 0 .74±0 .0 4 ,再灌注 2 4h达到高峰 ( 1.13± 0 .11) ,再灌注 72h后仍有较高表达 ( 0 .80± 0 .12 )。结论 脑缺血再灌注后CAD基因表达上调 。

杉木CAD基因生物信息学分析

杉木CAD片段为信息探针,利用序列拼接方法获得了738bp的cDNA序列.利用MEGA4.0软件对不同进化层次的代表植物相应CAD基因进行比对,构建系统进化树.利用生物信息学方法分析了杉木CAD基因的结构与功能,其中包括核苷酸序列的组成、ORF识别、CpG岛、限制性酶切位点分析、卷曲螺旋、亲水性、糖基位点及二级结构.结果表明:杉木与铁杉的CAD基因具有99.00%的同源性;该序列在88～737bp片段上有一个开放性阅读框,该序列编码的是一个碱性蛋白,亲水性较强,疏水性较弱,信号肽序列为第1位～第11位,二级结构以α-螺旋(27.50%)与不规则盘绕(41.50%)为主,延伸链(22.50%)也是该蛋白的重要结构元件,β转角区域仅为8.50%.

接种枯萎病菌对甜瓜木质素合成相关酶活性及CmCADs表达的影响

【目的】明确接种枯萎病菌对甜瓜幼苗植株表型、木质素含量、木质素合成相关酶活性及肉桂醇脱氢酶(cinnamy alcohol dehydrogenase,CAD)基因表达的影响,找出响应枯萎病菌的CmCADs成员。【方法】选用抗枯萎病品种薄皮甜瓜‘彩虹7号’为试验材料。在甜瓜幼苗长至"三叶一心"时接种枯萎病菌-尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.melonis)。以长势相同的健康植株浇灌等量无菌水为对照。在接种后0、1、3、5、7和9 d观察甜瓜植株表型变化,并测定其营养器官中的木质素含量、木质素合成关键酶(苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)和CAD)活性及CmCADs的表达量。【结果】接种枯萎病菌后,甜瓜植株表型发生明显变化。在接种枯萎病菌后5 d甜瓜植株叶片出现轻微萎蔫,接种后9 d植株全部叶片均已萎蔫。甜瓜营养器官中木质素含量及木质素合成相关酶PAL、POD和CAD活性在接种枯萎病菌后与对照相比均有不同程度的升高。其中木质素含量在根、茎和叶中呈现出一致的变化趋势,即木质素含量均随着接种枯萎病菌后天数的延长而增加,且显著高于对照。PAL活性在甜瓜根和茎中呈现先升高后下降的变化趋势,在叶片中整体呈现升高的趋势且显著高于对照。POD活性在各时期均高于对照并呈现出不同的变化趋势。CAD活性在甜瓜根、茎、叶中变化趋势一致,均呈现先升高后下降的趋势。接种枯萎病菌后,CmCADs各成员在甜瓜营养器官中的表达表现出组织特异性。根中除Cm CAD4外,其他4个成员均在接种后7 d受强烈诱导。茎中各成员均无表达,而叶中Cm CAD2和Cm CAD5在接种后5 d受到强烈诱导。【结论】与对照相比,甜瓜营养器官中木质素含量及木质素合成相关酶PAL、POD和CAD活性在接种后均升高,表明木质素合成途径可能在甜瓜抵御枯萎病中起重要作用,根和叶中均受枯萎病菌诱导表达的Cm CAD2和Cm CAD5可能是响应枯萎病菌的CmCADs成员,并在甜瓜抗枯萎病中起一定作用。

家蚕细胞凋亡相关基因BmICAD的克隆、序列和功能分析及其在精巢中特异表达的初步研究

DREP-1基因在果蝇的细胞凋亡过程中对DNA的降解有重要调控作用。本研究将该基因序列在家蚕EST数据库中进行同源性检索,把检索到的EST序列进行电子延伸和克隆重叠群拼接,根据拼接结果设计引物进行PCR扩增并克隆测序验证,首次成功克隆了家蚕第一个ICAD基因BmICAD的cDNA:该cDNA全长844 bp,ORF长522 bp,编码含有174个氨基酸的蛋白;预测分子量为19.6 kDa,等电点为4.23,所编码蛋白与果蝇DREP-1的一致性(identity)为36%;虽然Northern印记杂交未检测到信号,但是RT-PCR结果显示,该基因在精巢中特异表达。

苎麻木质素合成酶CAD基因的cDNA克隆及表达分析

采用PCR结合RACE技术克隆苎麻栽培种湘苎3号CAD基因全长cDNA序列;再运用qRT–PCR技术对木质素含量不同的代表性苎麻品种湘苎1号、湘苎3号、湘潭大叶白和城步青麻的CAD基因在其茎秆韧皮部和木质部的表达进行定量分析;使用1%间苯三酚和25%盐酸对4种苎麻茎横切片进行特异染色,观察品种间木质素染色度。结果表明,获得的苎麻CAD基因cDNA序列全长为1 378 bp(GenBank登录号,KF758396),编码359个氨基酸,推导为苎麻肉桂醇脱氢酶(BnCAD)。该推导蛋白质与已报道的几种植物木质素合成酶CAD的同源性均达90%以上,其中与蒺藜苜蓿的同源性达97%。运用qRT–PCR方法对BnCAD基因表达的定量分析结果显示,苎麻CAD基因在湘苎1号和湘苎3号的韧皮部表达水平明显高于其在木质部的表达水平,而在城步青麻木质部的表达水平高于其在韧皮部的表达水平,该基因在湘潭大叶白的韧皮部和木质部表达量接近。4种苎麻茎横切片的木质素染色结果表明,品种间木质素染色度与CAD基因在其韧皮部的表达量成正相关。

杨树肉桂醇脱氢酶基因序列和表达模式分析及CAD4酶活性检测

应用生物信息学方法从杨树基因组数据库中筛选出19个杨树肉桂醇脱氢酶基因,它们聚为3类。序列分析表明,杨树CAD基因家族主要通过全基因组加倍和串联复制的方式进行扩张。杨树和拟南芥CAD家族共6对旁系同源基因,在较强的净化选择压力下进化。19个基因在杨树不同组织中均有表达,表达量较高的是PoptrCAD17、PoptrCAD4、PoptrCAD10和PoptrCAD7,其他基因表达相对较少,相同亚类的CAD基因表达变化趋势接近。从毛白杨中克隆得到PoptrCAD4,体外表达的CAD4酶催化活性很强,具有明显的松柏醇底物偏好。

CAD基因原核表达载体的构建及表达产物的活性鉴定

目的构建pCool-GST-ICAD/CAD的表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达具有生物学活性的CAD核酸酶。方法用PCR扩增CAD基因,将扩增产物克隆入pCool-GST-ICAD载体中构建出pCool-GST-ICAD/CAD表达载体。经酶切和电泳鉴定正确后,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达产物经亲和层析、离子交换层析及凝胶过滤等方法分离纯化,最后用SDS-PAGE和DNA降解实验进行鉴定。结果构建了pCool-GST-ICAD/CAD原核表达载体,重组载体转化后表达出毫克级水平的GST-ICAD/CAD蛋白复合体。经分离纯化后得到纯度很好的CAD-ICAD蛋白复合体,在SDS-PAGE电泳上呈现清晰的两条蛋白带。经DNA降解实验证明纯化所得的CAD蛋白具有非特异性降解DNA的核酸酶作用。结论成功制备了具有生物学活性的CAD核酸酶,为进一步研究细胞凋亡的作用机制提供了有效的制剂。

非洲菊CAD基因的密码子偏好性分析

[目的]研究非洲菊肉桂醇脱氢酶基因(Cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD)的密码子使用偏好性。[方法]从非洲菊转录组数据中筛选获得具有完整CDS的CAD基因,运用CodonW、EMBOSS、SPSS和Origin软件分析其密码子使用情况。[结论]筛选获得5条具有完整CDS的非洲菊CAD基因,其密码子偏好性较弱,编码氨基酸时倾向于使用较多的A或T。GC1s、GC2s、GC3s、GC和ENC之间无显著性的相关性。该基因编码氨基酸时除受突变压力的影响外,外界因素与自然压力影响较大。酵母菌真核表达系统适合作为异源表达系统,拟南芥则是较为理想的受体。[结论]该研究可为非洲菊CAD遗传转化研究奠定基础。

谷子CAD基因家族的鉴定及分析

木质素类型、含量等与谷子茎秆的强度具有密切关系,肉桂醇脱氢酶(Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase,CAD)是木质素生物合成过程中的一个关键酶。为探究谷子木质素合成过程中CAD基因家族的结构和功能,为CAD基因家族的进一步研究提供一定的参考,通过同源序列比对,在已知全基因组序列的xiaomi中共鉴定到13个SiCAD,分布于谷子1、2、4、6、7、9号染色体上。利用生物信息学方法对SiCAD基因家族成员进行亲缘关系、理化性质分析以及结构预测和表达谱分析。结果显示,SiCAD与狗尾草CAD的亲缘关系最近,且与豫谷1号CAD基因家族的同源性极高。13个SiCAD分属3个亚类,依次含有2、8、3个基因;结构预测结果显示,13个基因均为断裂基因,包含外显子数目为3~8个。表达谱分析结果表明,第1亚类基因SiCAD1具有时空表达差异性,在晋谷21号和xiaomi的茎中高表达,推测该基因编码谷子木质素生物合成的主要酶;第2亚类的SiCAD5和SiCAD8在晋谷21号和xiaomi的茎中也高表达,该基因可能也是谷子重要的CAD基因;其余SiCAD的表达量相对较低或不表达。

上颌窦鳞癌Bcl-2、Vegf、E-cad蛋白表达的临床意义

目的探讨基因Bcl-2、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、上皮钙粘附素(epithelial-cadherin,E-cad)蛋白产物在上颌窦癌中的表达情况及其临床意义.方法采用免疫组织化学方法,对55例上颌窦癌及20例正常鼻粘膜组织中基因Bcl-2、Vegf、E-cad蛋白产物进行检测.结果 1.Bcl-2在正常鼻腔粘膜组织中表达率为(10%).上颌窦癌中有较高表达(58.1%).Vegf在正常鼻腔粘膜组织中表达率(56.3%)明显高于上颌窦癌(30%)中表达;E-cad在正常鼻腔粘膜组织中表达率(80%)明显高于上颌窦癌(60%);Bcl-2、Vegf、E-cad阳性表达在鼻腔粘膜组织与上颌窦癌组织之间相比,均具有显著性差异.2.Vegf蛋白阳性率随临床分期的增加而升高,其中Ⅲ～Ⅳ期阳性率(70.9%)明显高于Ⅰ～Ⅱ期(37.5%)Bcl-2和E-cad阳性率在Ⅰ～Ⅱ期(79.1%、75%)高于Ⅲ～Ⅳ期(41.9%、48.3%)两者差异有显著性,P<0.05.结论 Bcl-2、E-cad、Vegf基因参与了上颌窦的癌变及发展过程,其表达水平是判断病情及制订合理的治疗方案的敏感基因学指标,具有重要的临床意义.

CAD基因在泛癌中的预后评估作用

目的探讨CAD基因在泛癌中的预后评估作用。方法从症基因组图谱数据库下载了33种肿瘤的转录组测序数据,同时下载了相应患者的临床信息、肿瘤突变负担和微卫星不稳定性的信息,使用log-rank检验与COX回归分析评估CAD基因表达与患者生存状况的关系,使用“ESTIMATE”法评估肿瘤微环境,使用“CIBERSORT”算法评估肿瘤免疫细胞浸润,使用Spearman相关评估CAD基因表达与靶标间的相关性。结果CAD基因在多种肿瘤组织中表达增高,并与不良预后相关。不同肿瘤中的结果具有很大程度上的一致性。CAD基因与多种肿瘤的肿瘤微环境密切相关。多种肿瘤的肿瘤突变负荷与微卫星不稳定相关。CAD基因与多种肿瘤的M0巨噬细胞浸润有关。结论CAD基因表达水平可以用于泛癌的预后评估,CAD基因高表达患者预后较差,需要制定个性化的治疗方案,加强护理与随访。

八角莲肉桂醇脱氢酶基因的克隆和表达分析

鬼臼毒素是八角莲的重要药效成分。利用同源克隆和RACE的方法,从八角莲的根中克隆了鬼臼毒素生物合成途径肉桂醇脱氢酶(Cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD)基因,长1 098 bp,编码由365个残基组成的氨基酸序列。八角莲CAD蛋白不含有质体定位的信号序列,与毛白杨(Populus tomentosa)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)等物种中CAD蛋白的一致性为67.25%;系统发育分析表明,它与拟南芥的At CAD7、At CAD8和AtCAD6蛋白亲缘关系较近,聚成一个簇。组织表达分析结果表明,八角莲CAD基因在根和茎中有表达,而叶片中表达不明显。本研究获得的CAD基因,为后续进行详细的功能解析,并进一步应用于鬼臼毒素的遗传调控,奠定了基础。