棉花CAD基因家族的生物信息学分析

苯丙烷代谢是植物重要的次生代谢途径之一,其代谢产物在植物的生长发育中发挥着重要作用。肉桂酸脱氢酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD)是苯丙烷代谢途径的关键酶之一,在棉花纤维品质形成中起着十分重要的调节作用。为了更好地了解CAD基因家族在二倍体雷蒙德氏棉(D5)和亚洲棉(A2)、四倍体陆地棉(AD1)和海岛棉(AD2)基因组中的数量和分布情况,通过生物信息学方法,在雷蒙德氏棉、亚洲棉、陆地棉和海岛棉全基因组中分别鉴定出16、16、28和25个CAD基因家族成员,进一步分析了这些CAD家族成员进行基因结构、染色体定位、保守域、进化关系及CAD基因在陆地棉不同器官组织中的表达等。结果表明,4个棉种全基因组分别编码16、16、28和25个CAD基因。亚细胞定位将这些棉花CAD基因的表达产物均定位于细胞质。雷蒙德氏棉有14个CAD成员基因分布在5条染色体上,亚洲棉有13个CAD成员基因分布在5条染色体上,陆地棉28个CAD成员基因、海岛棉25个CAD基因分别分布在10条染色体上;内含子/外显子结构分析表明,CAD基因结构较为复杂,均含有内含子和外显子;功能结构域分析发现,有棉花CAD蛋白具有高度保守的ADH_N和ADH_zinc_N 2个功能域;根据系统发育分析结果,将CAD基因家族分成3个亚类。大部分CAD基因在陆地棉的不同器官中均有表达,部分在棉花纤维中表达量较高。分析结果为进一步研究棉花CAD基因家族各成员的功能奠定了理论基础。

陆地棉CAD基因家族的进化和表达分析

【目的】对陆地棉CAD基因家族成员进行进化和表达分析,了解其在棉纤维发育中的作用。【方法】应用生物信息学方法,从棉花基因组中筛选出21个CAD基因,并对CAD的基因结构、染色体分布、基因倍增模式以及系统进化进行分析。利用深度表达数据分析CAD基因在棉纤维发育各时期的表达。对比观察拟南芥cad5突变体和野生型根毛表型。【结果】同源性高的CAD基因复制对之间有相似的基因结构;片段重复和串联重复是CAD基因扩增的主要方式。进化分析可知,CAD基因可分为七个亚组,且功能相近的基因聚类在相同亚组。利用深度测序表达数据分析可知,CAD基因在棉纤维各个发育时期均有表达。对比拟南芥cad5突变体和野生型根毛发现,突变体相比于野生型有更长的根毛。【结论】CAD基因参与了棉纤维的发育的过程,并对棉花纤维发育起到一定的调控作用。

转抗菌肽CAD基因酵母饲料添加剂的安全性评价

目的 通过对转抗菌肽CAD基因酵母饲料添加剂的安全性评价 ,研究和建立转基因饲料安全性的评价模型和检验方法。方法 通过对受体生物和外源基因表达产物的安全性 ,转基因酵母生物性状的遗传稳定性 ,抗菌杂合多肽基因及产物在环境和饲养动物体内的转移和蓄积等进行检验和评价 ,确认产品的安全性。结果及结论 转抗菌肽CAD基因酵母饲料的受体生物、外源基因表达产物是安全的 ,产品具有稳定的遗传性状 ,抗菌杂合肽CAD在饲养动物体内不蓄积 ,抗菌肽CAD基因不向其他微生物转移 。

亚麻CAD基因克隆及序列分析

以亚麻(Linum usitatissimum L.)为材料,研究木质素代谢的关键酶亚麻肉桂醇脱氢酶基因序列。分离了高纯度的RNA,以RNA为模板,用简并引物以RT-PCR的方法,克隆了亚麻CAD基因cDNA部分序列,长度为477bp,编码159个氨基酸残基。此cDNA序列为亚麻CAD基因序列。

榅桲果实CAD基因的克隆、序列分析及表达

【目的】研究榅桲果实木质化与CAD基因的关系。【方法】基于GenBank报道的近缘物种CAD基因cDNA序列,应用Primer Premier 5.0软件设计PCR扩增引物。提取榅桲总RNA,经反转录后合成cDNA,应用RT-PCR方法成功扩增出CAD基因片段并克隆到pMD18-T载体。通过DNAstar软件进行同源序列比对,ClustalX结合MEGA4.1软件构建系统进化树,采用Protparam在线程序分析蛋白质的理化性质,用DNAstar的Protean程序预测二级结构。通过间苯二酚染色鉴定果肉发育时期木质素的积累程度,并利用RT-qPCR对CAD基因在发育期时期的表达规律进行检测。【结果】榅桲CAD基因其开放阅读框(ORF)序列为1 071 bp,编码356个氨基酸,与其他物种序列同源性最高达96%,进化关系上与苹果较近。在果实6个发育时期,木质素积累逐渐降低,而CAD基因表达与果实木质化程度紧密相关,随着木质素合成趋缓呈现一个逐步下调的趋势。【结论】CAD基因是调控榅桲果实木质化的关键基因。

亚麻CAD基因克隆及反义表达载体的构建

本试验以亚麻(Linum usitatissimumL.)品种Argos为材料,分离了高纯度的RNA。用简并引物以RT-PCR的方法,克隆了亚麻CAD基因cDNA部分序列,长度为477bp,构建了pGEM-T-CAD质粒。用限制性内切酶EcoRI酶切pGEM-T-CAD质粒和载体pGEM-7Zf(-),进行连接,构建成中间表达载体pGEM-7Zf(-)-CAD质粒。用限制性内切酶XbaI和BamHI双酶切中间表达载体pGEM-7Zf(-)-CAD质粒和pBI121载体,进行连接,构建了亚麻CAD基因反义植物表达载体pBI121-antiNTCAD。

杉木CAD基因生物信息学分析

杉木CAD片段为信息探针,利用序列拼接方法获得了738bp的cDNA序列.利用MEGA4.0软件对不同进化层次的代表植物相应CAD基因进行比对,构建系统进化树.利用生物信息学方法分析了杉木CAD基因的结构与功能,其中包括核苷酸序列的组成、ORF识别、CpG岛、限制性酶切位点分析、卷曲螺旋、亲水性、糖基位点及二级结构.结果表明:杉木与铁杉的CAD基因具有99.00%的同源性;该序列在88～737bp片段上有一个开放性阅读框,该序列编码的是一个碱性蛋白,亲水性较强,疏水性较弱,信号肽序列为第1位～第11位,二级结构以α-螺旋(27.50%)与不规则盘绕(41.50%)为主,延伸链(22.50%)也是该蛋白的重要结构元件,β转角区域仅为8.50%.

大鼠脑缺血再灌注后半暗带CAD基因的表达改变

目的 探讨大鼠局灶性脑缺血再灌注后缺血半暗带Caspase 3激活的DNA酶 (CAD)基因的表达变化规律。方法 线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞 (MCAO)及再通模型。应用RT PCR技术检测MCAO再通后不同时相缺血半暗带皮质CAD基因的表达。结果 脑缺血再灌注 6h ,缺血半暗带皮质CADmRNA显著升高 ,密度比值为 0 .74±0 .0 4 ,再灌注 2 4h达到高峰 ( 1.13± 0 .11) ,再灌注 72h后仍有较高表达 ( 0 .80± 0 .12 )。结论 脑缺血再灌注后CAD基因表达上调 。

苎麻木质素合成酶CAD基因的cDNA克隆及表达分析

采用PCR结合RACE技术克隆苎麻栽培种湘苎3号CAD基因全长cDNA序列;再运用qRT–PCR技术对木质素含量不同的代表性苎麻品种湘苎1号、湘苎3号、湘潭大叶白和城步青麻的CAD基因在其茎秆韧皮部和木质部的表达进行定量分析;使用1%间苯三酚和25%盐酸对4种苎麻茎横切片进行特异染色,观察品种间木质素染色度。结果表明,获得的苎麻CAD基因cDNA序列全长为1 378 bp(GenBank登录号,KF758396),编码359个氨基酸,推导为苎麻肉桂醇脱氢酶(BnCAD)。该推导蛋白质与已报道的几种植物木质素合成酶CAD的同源性均达90%以上,其中与蒺藜苜蓿的同源性达97%。运用qRT–PCR方法对BnCAD基因表达的定量分析结果显示,苎麻CAD基因在湘苎1号和湘苎3号的韧皮部表达水平明显高于其在木质部的表达水平,而在城步青麻木质部的表达水平高于其在韧皮部的表达水平,该基因在湘潭大叶白的韧皮部和木质部表达量接近。4种苎麻茎横切片的木质素染色结果表明,品种间木质素染色度与CAD基因在其韧皮部的表达量成正相关。

CAD基因原核表达载体的构建及表达产物的活性鉴定

目的构建pCool-GST-ICAD/CAD的表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达具有生物学活性的CAD核酸酶。方法用PCR扩增CAD基因,将扩增产物克隆入pCool-GST-ICAD载体中构建出pCool-GST-ICAD/CAD表达载体。经酶切和电泳鉴定正确后,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达产物经亲和层析、离子交换层析及凝胶过滤等方法分离纯化,最后用SDS-PAGE和DNA降解实验进行鉴定。结果构建了pCool-GST-ICAD/CAD原核表达载体,重组载体转化后表达出毫克级水平的GST-ICAD/CAD蛋白复合体。经分离纯化后得到纯度很好的CAD-ICAD蛋白复合体,在SDS-PAGE电泳上呈现清晰的两条蛋白带。经DNA降解实验证明纯化所得的CAD蛋白具有非特异性降解DNA的核酸酶作用。结论成功制备了具有生物学活性的CAD核酸酶,为进一步研究细胞凋亡的作用机制提供了有效的制剂。

非洲菊CAD基因的密码子偏好性分析

[目的]研究非洲菊肉桂醇脱氢酶基因(Cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD)的密码子使用偏好性。[方法]从非洲菊转录组数据中筛选获得具有完整CDS的CAD基因,运用CodonW、EMBOSS、SPSS和Origin软件分析其密码子使用情况。[结论]筛选获得5条具有完整CDS的非洲菊CAD基因,其密码子偏好性较弱,编码氨基酸时倾向于使用较多的A或T。GC1s、GC2s、GC3s、GC和ENC之间无显著性的相关性。该基因编码氨基酸时除受突变压力的影响外,外界因素与自然压力影响较大。酵母菌真核表达系统适合作为异源表达系统,拟南芥则是较为理想的受体。[结论]该研究可为非洲菊CAD遗传转化研究奠定基础。

CAD基因在泛癌中的预后评估作用

目的探讨CAD基因在泛癌中的预后评估作用。方法从症基因组图谱数据库下载了33种肿瘤的转录组测序数据,同时下载了相应患者的临床信息、肿瘤突变负担和微卫星不稳定性的信息,使用log-rank检验与COX回归分析评估CAD基因表达与患者生存状况的关系,使用“ESTIMATE”法评估肿瘤微环境,使用“CIBERSORT”算法评估肿瘤免疫细胞浸润,使用Spearman相关评估CAD基因表达与靶标间的相关性。结果CAD基因在多种肿瘤组织中表达增高,并与不良预后相关。不同肿瘤中的结果具有很大程度上的一致性。CAD基因与多种肿瘤的肿瘤微环境密切相关。多种肿瘤的肿瘤突变负荷与微卫星不稳定相关。CAD基因与多种肿瘤的M0巨噬细胞浸润有关。结论CAD基因表达水平可以用于泛癌的预后评估,CAD基因高表达患者预后较差,需要制定个性化的治疗方案,加强护理与随访。

家蚕细胞凋亡相关基因BmICAD的克隆、序列和功能分析及其在精巢中特异表达的初步研究

DREP-1基因在果蝇的细胞凋亡过程中对DNA的降解有重要调控作用。本研究将该基因序列在家蚕EST数据库中进行同源性检索,把检索到的EST序列进行电子延伸和克隆重叠群拼接,根据拼接结果设计引物进行PCR扩增并克隆测序验证,首次成功克隆了家蚕第一个ICAD基因BmICAD的cDNA:该cDNA全长844 bp,ORF长522 bp,编码含有174个氨基酸的蛋白;预测分子量为19.6 kDa,等电点为4.23,所编码蛋白与果蝇DREP-1的一致性(identity)为36%;虽然Northern印记杂交未检测到信号,但是RT-PCR结果显示,该基因在精巢中特异表达。

杨树肉桂醇脱氢酶基因序列和表达模式分析及CAD4酶活性检测

应用生物信息学方法从杨树基因组数据库中筛选出19个杨树肉桂醇脱氢酶基因,它们聚为3类。序列分析表明,杨树CAD基因家族主要通过全基因组加倍和串联复制的方式进行扩张。杨树和拟南芥CAD家族共6对旁系同源基因,在较强的净化选择压力下进化。19个基因在杨树不同组织中均有表达,表达量较高的是PoptrCAD17、PoptrCAD4、PoptrCAD10和PoptrCAD7,其他基因表达相对较少,相同亚类的CAD基因表达变化趋势接近。从毛白杨中克隆得到PoptrCAD4,体外表达的CAD4酶催化活性很强,具有明显的松柏醇底物偏好。

酿酒酵母抗镉基因CAD1的克隆和分析

目的:克隆CAD1基因,对其结构和功能进行预测,为后期研究利用该基因用于重金属镉的解毒作用及其他有毒物质的抗性研究打下基础。方法:使用PCR技术对酿酒酵母BZL06的CAD1基因序列进行全长克隆,再对其进行染色体定位和亲缘关系分析,使用在线分析工具ExPASy、ProtParam等对其编码蛋白质的一级结构、二级结构、三级结构、结构域和蛋白互作进行预测分析。结果:该CAD1基因位于Ⅳ染色体1318046~1319275;全长1230 bp,可编码409个氨基酸,亲缘关系分析表明该基因与酿酒酵母CEN.PK113-7D菌株CAD1基因(GenBank序列号为EIW11633.1)最为接近,同源性达到99%;编码的蛋白质为在细胞核中进行代谢调控的不稳定的亲水蛋白;存在明显的卷曲螺旋区域,不存在跨膜结构,二级结构预测中发现该蛋白主要存在α-螺旋和随机卷曲,β-转角与延伸链分散分布;预测存在bZIP和PAP1结构域;蛋白互作分析中相关系数0.7以上的蛋白有9个,其中相关系数为0.937的SKN7蛋白是CAD1蛋白。结论:分析结果得出克隆CAD1基因正确,其编码的蛋白结构不稳定,在细胞核中代谢,含有与重金属镉与其他有毒物的过表达中存在抗性的表达紧密相关的结构域bZIP和PAP1,在表达抗性时并与SKN7蛋白功能联系密切。

2例CAD基因缺陷患儿的临床护理体会

CAD基因缺陷可导致常染色体隐性遗传早发婴儿癫痫性脑病50型,是目前极少数可治疗的神经遗传代谢病之一。目前报道例数较少,本课题组报道国内第1例CAD基因缺陷患儿,该病可表现为难治性癫痫、贫血伴红细胞形态异常和智力运动发育落后,未应用尿苷治疗患儿通常在儿童期死亡。因此,确诊前需要护理人员针对患儿病情制定及时有效的护理诊断,给予相应的护理措施,保证患儿生命安全。本研究拟总结2例CAD基因缺陷患儿住院期间以及出院后追踪随访的护理体会。经过积极有效的治疗及护理,2名患儿未发生严重并发症,癫痫发作得到有效控制,患儿家长对治疗效果满意,出院后随访患儿治疗运动发育逐渐进步。

小立碗藓CAD1基因敲除载体的构建及酶切方法优化

苔藓植物能否合成木质素目前还存在一定的争议。肉桂醇脱氢酶(CAD)催化木质素单体合成的最后一步反应,Real-TimePCR表达分析表明,小立碗藓CAD1基因在接种灰霉菌后的第2天表达量迅速上升。本试验利用PCR技术,以小立碗藓基因组DNA为模板,使用Primer5-Cracked设计的引物,扩增出小立碗藓CAD1基因的上、下游同源臂基因片段。酶切CAD1上游同源臂和pTN182原始质粒,经连接酶连接、转化至感受态大肠杆菌,筛选出阳性株。采用裂解液裂解、质粒DNA提取、质粒PCR以及酶切进行验证,得到CAD11-pTN182。采用同样的方法把下游片段转入CAD11-pTN182,即得CAD11-pTN182-CAD12,最后进行测序分析。结果表明,已成功构建CAD11-pTN182-CAD12敲除载体,并将该重组质粒转入目的菌株大肠杆菌中保存备用,可为后续进行小立碗藓CAD1基因敲除,验证小立碗藓CAD1基因功能,进一步了解模式植物小立碗藓防卫反应机理研究奠定良好基础。

八角莲肉桂醇脱氢酶基因的克隆和表达分析

鬼臼毒素是八角莲的重要药效成分。利用同源克隆和RACE的方法,从八角莲的根中克隆了鬼臼毒素生物合成途径肉桂醇脱氢酶(Cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD)基因,长1 098 bp,编码由365个残基组成的氨基酸序列。八角莲CAD蛋白不含有质体定位的信号序列,与毛白杨(Populus tomentosa)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)等物种中CAD蛋白的一致性为67.25%;系统发育分析表明,它与拟南芥的At CAD7、At CAD8和AtCAD6蛋白亲缘关系较近,聚成一个簇。组织表达分析结果表明,八角莲CAD基因在根和茎中有表达,而叶片中表达不明显。本研究获得的CAD基因,为后续进行详细的功能解析,并进一步应用于鬼臼毒素的遗传调控,奠定了基础。