酿酒酵母抗镉基因CAD1的克隆和分析

目的:克隆CAD1基因,对其结构和功能进行预测,为后期研究利用该基因用于重金属镉的解毒作用及其他有毒物质的抗性研究打下基础。方法:使用PCR技术对酿酒酵母BZL06的CAD1基因序列进行全长克隆,再对其进行染色体定位和亲缘关系分析,使用在线分析工具ExPASy、ProtParam等对其编码蛋白质的一级结构、二级结构、三级结构、结构域和蛋白互作进行预测分析。结果:该CAD1基因位于Ⅳ染色体1318046~1319275;全长1230 bp,可编码409个氨基酸,亲缘关系分析表明该基因与酿酒酵母CEN.PK113-7D菌株CAD1基因(GenBank序列号为EIW11633.1)最为接近,同源性达到99%;编码的蛋白质为在细胞核中进行代谢调控的不稳定的亲水蛋白;存在明显的卷曲螺旋区域,不存在跨膜结构,二级结构预测中发现该蛋白主要存在α-螺旋和随机卷曲,β-转角与延伸链分散分布;预测存在bZIP和PAP1结构域;蛋白互作分析中相关系数0.7以上的蛋白有9个,其中相关系数为0.937的SKN7蛋白是CAD1蛋白。结论:分析结果得出克隆CAD1基因正确,其编码的蛋白结构不稳定,在细胞核中代谢,含有与重金属镉与其他有毒物的过表达中存在抗性的表达紧密相关的结构域bZIP和PAP1,在表达抗性时并与SKN7蛋白功能联系密切。

小立碗藓CAD1基因敲除载体的构建及酶切方法优化

苔藓植物能否合成木质素目前还存在一定的争议。肉桂醇脱氢酶(CAD)催化木质素单体合成的最后一步反应,Real-TimePCR表达分析表明,小立碗藓CAD1基因在接种灰霉菌后的第2天表达量迅速上升。本试验利用PCR技术,以小立碗藓基因组DNA为模板,使用Primer5-Cracked设计的引物,扩增出小立碗藓CAD1基因的上、下游同源臂基因片段。酶切CAD1上游同源臂和pTN182原始质粒,经连接酶连接、转化至感受态大肠杆菌,筛选出阳性株。采用裂解液裂解、质粒DNA提取、质粒PCR以及酶切进行验证,得到CAD11-pTN182。采用同样的方法把下游片段转入CAD11-pTN182,即得CAD11-pTN182-CAD12,最后进行测序分析。结果表明,已成功构建CAD11-pTN182-CAD12敲除载体,并将该重组质粒转入目的菌株大肠杆菌中保存备用,可为后续进行小立碗藓CAD1基因敲除,验证小立碗藓CAD1基因功能,进一步了解模式植物小立碗藓防卫反应机理研究奠定良好基础。

亚洲棉(+)-δ-杜松烯合成酶基因CAD1-A的分离及其在幼苗中的表达特征分析

棉花倍半萜环化酶，即（＋）－δ－杜松烯合成酶（ＣＡＤ），由一个基因家族编码．该 基因家族可分为两个亚族：ＣＡＤ１－Ａ和ＣＡＤ１－Ｃ．分离了亚洲棉ＣＡＤ１－Ａ基因．对亚洲棉 ７天龄幼苗的ｍＲＮＡ原位杂交表明，ＣＡＤ１－Ａ和ＣＡＤ１－Ｃ的转录子主要分布在侧根原 基、顶端分生组织和新生侧根的维管组织中，在幼苗下胚轴的原形成层和部分表皮、下 表皮细胞中也有分布．ＣＡＤ１－Ａ启动子在转基因烟草中表现出相似的活性．组织化学实 验发现，倍半萜醛类分布于侧根根尖的外层细胞以及地上部分的色素腺体中．ＣＡＤ１基 因在亚洲棉幼苗中的表达特征，以及倍半萜醛类的分布特征，组成了棉花幼苗的化学 防御体系。

装配工艺文件的自动生成

装配工艺文件是指导装配人员进行现场装配操作的重要依据 ,对产品的最终质量有着非常重要的影响 ,故制作准确详尽的装配工艺文件是装配工艺规划中的一个极其关键的环节。手工制作装配工艺文件的效率低、工作强度大 ,已不能满足广大企业的需求。装配工艺规划后处理器 (PostAssemblyProcessPlanningManager,PAPPM)是一个基于Pro/Engineer软件平台的功能模块 ,它借助计算机辅助手段 ,根据CAD和CAAPP(ComputerAidedAssemblyPro cessPlanning)的设计结果 ,以人机交互为辅、计算机推理为主的方式生成装配工艺文件。本文结合对PAPPM的介绍 ,探讨了装配工艺文件自动生成中的关键技术。

植物螯合肽合酶基因AtPCS2的表达调控

植物螯合肽合酶(PCS)受重金属离子激活,并以还原型谷胱甘肽为底物合成植物螯合肽(PCs),在植物和真菌的重金属解毒机制中起重要作用.拟南芥基因组中有两个编码PCS的基因AtPCS1和AtPCS2,但AtPCS1单基因功能缺失即可导致相应的突变体cad1-3对镉高度敏感,其体内也检测不到PCs;而体外表达分析表明,AtPCS2具有完全的PCs合酶活性,预示植物体内可能存在AtPCS2的负向调控机制.基于该推测,构建了CaMV 35S启动子驱动的AtPCS2基因编码区与c-Myc抗原标签融合的过表达载体.结果表明,在cad1-3的CaMV 35S/AtPCS2:cMyc的异位表达株系中,AtPCS2的mRNA和蛋白都保持较高的表达量.不仅如此,AtPCS2具有植物螯合肽合成能力,并完全互补了cad1-3突变体的镉敏感性状.AtPCS2和EYFP的融合蛋白在细胞质有明显表达,在细胞核也检测到一定信号.以上结果表明,AtPCS2在植物体内可能主要受转录水平调控,而且可能具有调节PCs合成以外的其他生化功能.