鼠疫耶尔森菌caf1基因缺失株体外生物学特性和对小鼠致病性分析

目的探索caf1基因缺失对鼠疫耶尔森菌体外生物学特性与对小鼠致病性的影响.方法利用CRISPR/Cas12a介导的基因编辑技术构建鼠疫耶尔森菌caf1基因缺失株,并通过PCR技术对caf1基因缺失验证.比较鼠疫耶尔森菌caf1基因缺失株和野生株201在生长速率、液体培养状态、聚集情况等体外生物学特性和对小鼠致病性等方面的差异.结果PCR扩增结果证实,caf1基因缺失株构建成功.体外生物学特征分析表明,与野生株相比,caf1基因缺失株的形态学和生长速率并未发生明显变化,自凝聚率升高.肺递送途径LD50分析表明,caf1的缺失导致鼠疫耶尔森菌气溶胶感染小鼠半数致死剂量显著降低.结论不同途径感染结果表明,caf1基因缺失株相较于野生株,在肺递送、滴鼻、皮下、尾静脉注射4种途径下对BALB/c小鼠的毒力均降低.caf1基因的缺失导致鼠疫耶尔森菌自凝聚率升高,对BALB/c小鼠致病性下降.

caf1基因为靶标的鼠疫检测PCR法的改进

目的查明行业标准推荐caf1基因引物（简称行标caf1引物）进行PCR检测时，在一些非鼠疫菌上出现非特异性条带的原因，并提出解决办法。方法共选取112株菌进行试验，其中鼠疫菌40株、非鼠疫菌72株；提取菌株DNA，并对caf1基因进行PCR扩增；选择出现非特异性条带的7株菌株，进行切胶回收、纯化以及TA克隆测序；针对caf1基因重新设计引物，对被试菌株进行验证。结果使用行标caf1引物扩增40株鼠疫菌，均未出现非特异性条带，扩增72株非鼠疫菌，有58株扩增出400、500、600、700、800、900、1 000 bp的非特异性条带。经克隆和测序，在非特异性产物的基因序列中均出现行标caf1引物的反向引物序列及反向引物的反向互补序列。重新设计caf1引物，扩增72株非鼠疫菌，均未出现非特异性条带。结论行标caf1引物在筛查鼠疫菌时会出现非特异性条带，使用新caf1引物可有效避免这一情况，提高检测的准确性。

利用瞬时表达技术分析小麦抗白粉病相关基因CAF1、BI-1和DAD1的功能

利用小麦离体叶片瞬时表达技术分析了3个小麦抗白粉病相关基因CAF1、BI-1和DAD1的功能。根据小麦响应白粉菌侵染的差异表达基因芯片检测结果,筛选出表达差异的抗病相关基因CAF1和BI-1,并挑选与植物程序性死亡相关的基因DAD1,将克隆到的这3个小麦基因全长ORF序列构建入超表达载体pAHC25中,利用瞬时表达技术检测目标基因和GUS基因共转化的阳性小麦叶片表皮细胞中白粉菌成功侵入并形成吸器的细胞比例(侵入频率),研究目标基因的超表达后对白粉菌入侵及吸器形成产生的影响。结果表明,小麦CAF1基因在感病小麦品种叶片中的瞬时表达,对白粉病侵入和吸器形成具有一定的抑制作用(侵入频率为(37.37±3.2)%,对照为(54.75±0.6)%),在一定程度上增强了表达细胞对白粉菌的抗性;表达DAD1基因则可能在一定程度上有利于白粉菌吸器的形成(侵入频率为(57.34±1.1)%,对照为(50.93±1.3)%);而在感病叶片中表达基因BI-1对白粉菌吸器形成没有明显影响(侵入频率为(54.31±1.7)%,对照为(52.37±1.8)%)。

鼠疫耶尔森氏菌caf1和pH6基因的原核表达

目的利用DNA重组技术,在大肠杆菌中获得融合表达的鼠疫耶尔森氏菌caf1及p H6抗原基因。方法利用分子克隆技术克隆后,在原核系统中表达鼠疫菌重要功能蛋白caf1及p H6蛋白,根据云南玉龙菌株(D106004)全基因组序列设计引物,PCR扩增目的基因片段;采用p ET-32a(+)作为表达载体,通过双酶切和连接反应,将目的基因片段定向插入载体中,构建重组表达质粒;IPTG诱导,使重组质粒在其宿主菌E.coli BL21(DE3)中表达。结果根据酶切鉴定和PCR产物测序结果显示,目的基因caf1及p H6已成功连接到表达载体p ET-32a(+)上,SDS-PAGE结果显示表达产物的相对分子质量约为34.2 ku和35.5 ku,与理论分子量一致。结论成功克隆并构建了p ET32a-caf1及p ET32a-p H6重组基因原核表达系统,为鼠疫潜在诊断靶点及新型疫苗选择的可能性奠定了基础。

PCR检测鼠疫菌种中F1抗原基因

目的应用PCR检测试验用EV菌株是否存在caf1基因。方法应用含内部对照PCR技术,以鼠疫菌特异基因caf1合成一对引物,进行PCR实验。结果该试验用EV菌株经PCR扩增,呈现一条与caf1基因分子量相吻合的清晰目的扩增带。结论该试验用EV菌株未缺失产生F1抗原的基因,可以用于提取F1抗原等试验。

鼠疫耶尔森菌pla抗原基因芯片检测法的验证

目的检验鼠疫耶尔森菌pla抗原基因芯片检测法的准确性。方法针对鼠疫耶尔森菌pPCP1质粒上pla抗原基因中保守性片段,设计合成探针,制备尼龙膜基因芯片,用于检测在镇赉国家级鼠疫监测点采集到的达乌尔黄鼠肺、肝、肾样本154份,然后用鼠疫caf1基因PCR扩增法复检基因芯片阳性样品。结果基因芯片共检测出18份样本呈阳性反应,而caf1基因PCR法却发现这些样品均为阴性。结论在鼠疫耶尔森菌pPCP1质粒上的pla抗原基因不易用于鼠疫耶尔森菌的特异性检测,该抗原可同其它特异性抗原联合应用,提高检测的准确性。