幽门螺杆菌CagA蛋白与胃癌组织中Bcl-2、p53蛋白表达的关系

目的:CagA+H.pylori感染与胃癌的相关性在我国报道不一,且致癌机制不祥.本研究应用ELISA法检测H.pylori相关胃癌和慢性胃病血清中抗CagA抗体和免疫组化方法检测全部组织标本中Bcl-2、p53蛋白的表达,研究H.pyloriCagA阳性株感染与胃癌、慢性胃病的相关性及与胃黏膜组织中Bcl-2、p53蛋白表达的相互关系,探讨H.pylori的致癌机制.方法:79例患者(胃癌50例、萎缩性胃炎17例、胃溃疡伴不典型增生5例、浅表性胃炎7例)胃镜诊断明确后取胃窦或病变部位活检,用于H.pylori的诊断、病理诊断及免疫组化检测Bcl-2、p53蛋白的表达.H.pylori的诊断采用快速尿素酶试验和ELISA法血清H.pylori抗体或病理Warthin-Starry银染色,两项阳性诊断为H.pylori阳性.用ELISA法检测患者血清CagA-H.pylori抗体,用免疫组化方法检测全部组织标本中Bcl-2、p53蛋白的表达.结果:胃癌组CagA+H.pylori感染阳性率86%(43/50)高于慢性胃病组45%(13/29)(P<0.01),有显著性差异.Bcl-2蛋白表达:胃癌组高于慢性胃病组(62%vs41%;P>0.05),胃癌CagA+组高于CagA-组(65%vs43%;P>0.05),慢性胃病CagA+组显著高于CagA-组(77%vs12%;P<0.01).p53蛋白表达:胃癌组显著高于慢性胃病组(54%vs28%;P<0.05),胃癌CagA+组显著高于CagA-组(60%vs14%;P<0.05),慢性胃病CagA+组显著高于CagA-组(46%vs12%;P<0.05).结论:胃癌患者CagA+H.pylori感染明显高于慢性胃病者,CagA+H.pylori感染与胃癌发生明显相关,而H.pylori的CagA可使癌前疾病组织中出现Bcl-2蛋白表达,且随着Bcl-2蛋白表达增加疾病的严重程度也增加,即在细胞恶性转化的早期阶段就发挥作用,并逐渐增强,导致胃上皮细胞增生增加,凋亡减少.增生的过程中继而出现p53基因的突变,即突变型p53蛋白表达增强,诱导凋亡作用减弱.

血清幽门螺杆菌CagA蛋白抗体滴度与消化性溃疡的关系

目的 通过比较消化性溃疡和慢性胃炎病人血清中CagA抗体阳性的流行情况 ,探讨消化性溃疡和血清幽门螺杆菌CagA蛋白抗体滴度之间的关系。方法 采用病例对照研究设计方案。研究对象来源于中山医院门诊因中上腹痛或腹胀进行胃镜检查的人群。自 1998年 10月 -1998年 12月共收集胃溃疡病例 2 6例 ,十二指肠球部溃疡 2 7例 ,对照组为同期胃镜和病理证实慢性浅表性胃炎的病例 6 5例。Hp感染的判断采用快速尿素酶和病理Giemsa相结合的方法 ,二者均阳性定为阳性。采用ELISA方法检测HpCagA抗体。结果 总的HpCagA抗体的阳性率为 6 2 5 % ,在胃溃疡组为 76 9% ( 2 0 / 2 6 ) ,在十二指肠球部溃疡组为 88 9% ( 2 4/ 2 7) ,在慢性胃炎组为 49 3 % ( 3 2 / 6 5 ) ,胃溃疡组和十二指肠球部溃疡组均明显高于慢性胃炎组 ,差异有显著性。结论 本研究提示CagA蛋白阳性的幽门螺杆菌菌株在消化性溃疡的发病中起一定作用。

成人慢性免疫性血小板减少症与幽门螺杆菌CagA蛋白的临床相关性研究

目的探讨幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)CagA蛋白(H.pylori-CagA)在慢性免疫性血小板减少症(Chronic Immune thrombocytopenia,CITP)患者发病中的作用。方法收集四川省人民医院110例伴有H.pylori感染的CITP患者,按就诊先后顺序编号后,应用随机数字表分为治疗组与对照组各55例,进行CagA蛋白抗体定性、定量检测。治疗组接受根除H.pylori治疗,对照组不接受根除H.pylori治疗,其他治疗方案两组相同。6～8周后复查14碳尿素酶呼气试验(14C-urea breath test,14C-UBT),3～5个月随访监测患者治疗前后血小板计数、H.pylori-CagA-IgG浓度变化,比较两组间是否存在显著差异,进而探讨CITP与幽门螺杆菌CagA蛋白的临床相关性。结果 110例患者中46例CagA蛋白抗体阳性,CagA阳性率41.82%(46/110);治疗组23例H.pylori-CagA阳性病例根除H.pylori治疗后血小板计数明显改善,H.pylori-CagA蛋白抗体滴度较前降低,且有效率明显高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);而32例CagA蛋白抗体阴性病例治疗前后血小板数量变化无统计学意义(P>0.05)。对照组23例H.pylori-CagA阳性病例H.pylori-CagA蛋白抗体滴度及血小板数量变化无统计学意义(P>0.05);32例CagA蛋白抗体阴性病例,治疗前后血小板数量变化无统计学意义(P>0.05)。提示H.pylori-CagA蛋白与CITP的发生、发展密切相关。结论对有H.pylori感染的CITP患者增加血清抗体检测,对于临床上治疗CITP可能有良好的预测作用且H.pylori-CagA抗体阳性者进行根除H.pylori治疗可作为一个新的非免疫治疗的方法,不良反应少。

成人特发性血小板减少性紫癜与幽门螺杆菌CagA蛋白的关系

目的了解成人特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP)与幽门螺杆菌(helicobacter pylori,Hp)CagA蛋白的关系。方法采用14C尿素呼吸试验对正常成人和ITP患者进行Hp检测后,对Hp阳性的ITP患者进行CagA蛋白抗体检测。依据急性ITP,慢性ITP,难治性ITP对ITP患者进行分类。结果 223例正常患者中123例Hp阳性,感染率为55.2%,而CagA蛋白抗体阳性为42例,占34.1%。278例ITP患者中Hp阳性176例,感染率63.3%,其中CagA蛋白抗体阳性83例,占47.2%,ITP患者的Hp感染率与正常人相似,但CagA蛋白抗体阳性率显著高于正常人(P<0.05)。Hp感染率及CagA蛋白抗体阳性率在急性ITP患者中分别为62.2%和46.4%,慢性ITP为63.2%和47.0%,难治性ITP为64.7%和48.5%,比较显示不同类型的ITP患者Hp感染率及CagA抗体阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。结论纳入研究的ITP患者的Hp感染率与正常人相似,但CagA蛋白抗体阳性率明显高于正常人,提示CagA蛋白在成人ITP的发生发展中具有一定作用。进一步分析也显示不同类型的ITP患者Hp感染率及CagA蛋白阳性率差异无统计学意义。

幽门螺杆菌cagA蛋白的克隆表达与鉴定

目的 构建表达幽门螺杆菌 (Hp)毒素相关基因A蛋白 (cagA)的重组质粒 ,并在大肠杆菌中表达获得基因重组蛋白 ,为检出幽门螺杆菌致病株和运用于临床检测Hp感染奠定基础。 方法 PCR扩增出编码毒素相关基因蛋白DNA片段后构建出重组质粒 pET -cagA ,并经质粒酶切筛选、DNA测序、IPTG诱导DE3 表达融合蛋白和Western blot予以证实。表达的融合cagA蛋白经过纯化和凝血酶酶切验证cagA蛋白抗原性。 结果 克隆的cagA核苷酸序列与GeneBank(AB116 74 4 )公布的序列相比较 ,同源性达 99.34% ,推定氨基酸序列同源性为 99.0 1%。SDS -PAGE和Western blot检测到带有His tag的约 4 0kD融合蛋白中表达。融合蛋白酶切后能与抗cagA人抗血清发生阳性反应。 结论 重组cagA的原核表达质粒构建正确 ,蛋白表达成功 。

幽门螺杆菌cagA基因3’端可变区和CagA蛋白EPIYA基序研究进展

细胞毒素相关基因A（cagA）编码CagA蛋白，是研究最多的幽门螺杆菌（H．pylori）基因之一。CagA蛋白经由Ⅳ型分泌系统进入Hpylori黏附的胃上皮细胞，其C-端发生酪氨酸磷酸化，磷酸化的CagA可引起细胞骨架重排、诱导细胞发生形态学变化、增强细胞动力，造成细胞异常运动和增殖．最终导致癌变。因此cagA阳性H．pylori菌株较cagA阴性菌株毒力更强。cagA基因3’端可变区重复序列数目的差异造成了cogA基因结构的多态性以及CagA蛋白大小、功能和细菌毒力（致病性）的差异。因此，cagA基因3’端可变区及其蛋白的EPIYA基序与H．pylori感染临床结果的相关性，成为目前H.pylori研究的热点之一。

幽门螺杆菌CagA蛋白N端片段的表达、纯化及其与磷脂酰丝氨酸的亲和力检测

目的:表达和纯化幽门螺杆菌不同菌株的CagA蛋白N端片段,检测其与磷脂酰丝氨酸(PS)的相互作用及亲和力。方法:用PCR方法从幽门螺杆菌3个菌株中扩增出CagA蛋白N端基因,并连接到表达载体pET-28a上;转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导可溶性表达CagA蛋白N端880残基片段;经镍柱亲和纯化后,利用PLOA法检测CagA蛋白与PS的相互作用。结果:构建了3种幽门螺杆菌菌株cagA基因的原核表达质粒pET-28a/cagAJ99、pET-28a/cagA11637及pET-28a/cagASS1,并在大肠杆菌中获得可溶性表达,SDS-PAGE和Western印迹证实得到目标融合蛋白,亲和纯化得到高纯度CagA蛋白。PLOA结果表明,CagA蛋白与PS有明显的相互作用。结论:3种幽门螺杆菌菌株CagA蛋白与PS之间存在相互作用,且不同的CagA与PS有不同的亲和力。

应用SAS软件分析CagA蛋白序列可变区的多态性

目的:应用SAS软件进行数据挖掘,系统阐明幽门螺杆菌(H.pylori)CagA序列多态性及其特性。方法:采用SAS软件数据加工整理技术与生物信息学软件序列分析比对相结合的方法,对NCBI、swiss_prot/tremble、DDBJ三大蛋白数据库有关CagA蛋白序列数据进行整理,建立含97条完整序列及268条3’端部分序列的数据仓库,并对其进行多态性分析。结果:通过SAS程序对数据的整理加工后观察、统计分析,明确了可变区的位置及长度,准确地得出了EPIYA基序的重复频率、多态性及概率分布,EPIYA基序间隔序列的种类、特征及频度。CagA蛋白氨基酸序列长短不等主要是由于可变区的变化引起,可变区平均长度115.76±27.38aa。365例H.pylori菌株CagA可变区内EPIYA基序平均重复3.28±0.72次,最少1次,最多7次。EPIYA有9种突变型,占总数的7.18%。2个EPIYA基序之间的间隔序列,主要有7种,其中R3C、R4C中"FPLKRHDKVDELIKVG"及"TIDDLGGP"是西方株的特征基序,R3D中的"KIASAGKGVGGFSGAG",R4D中的"FPLRRSAAVNDLSKVG"及"TIDFDEAN"则是东亚株特征序列。EPIYA及其间隔序列不同组合构成CagA可变区17种不同的类型。在东亚株中EPIYA基序重复次数及EPIYA-D位点数明显少于西方株,EPIYA-A、EPIYA-B位点则多于西方株。结论:应用SAS软件可有效地对CagA蛋白可变区的多态性分析,从整体上把握了CagA可变区的序列特征,较以往的描述更详细、系统、合理。由于CagA序列可变区多态性的特点及与细胞毒性的关系,在此基础上进一步的研究可能揭示更多的分子生物学机制。

幽门螺杆菌cagA蛋白及其疫苗候选抗原对T细胞Fas Ligand介导凋亡的调节作用

目的 评价幽门螺杆菌 (Hp)多种功能蛋白致T细胞凋亡的能力 ,以探求它们在Fas/FasL介导的机体T细胞耐受中的作用 ,为Hp疫苗研制寻求安全有效的免疫原。方法 应用JAM技术对cagA阳性Hp及同源基因突变株、重组尿素酶、粘附素HpaA及外膜蛋白Hop2 5、35、38致T细胞系凋亡的能力进行了比较 ;应用流式细胞术对上述因素特别是cagA阳性菌株诱导T细胞FasL表达的能力进行了检测 ;应用金属蛋白酶抑制剂和蛋白合成抑制剂分别提高和降低Hp介导的T细胞凋亡 ,以证实其与FasL合成的关系。结果 HpcagA阳性株无论在提高T细胞表达FasL还是在诱导T细胞凋亡方面的作用均强于同源基因突变株。Hp抗原制品中尿素酶对T细胞无杀伤能力 ,而Hop38毒性最强 ,Hop2 5、Hop35和HpaA等作用较弱。金属蛋白酶抑制剂提高了cagA阳性Hp致T细胞凋亡的能力 ,而蛋白合成抑制剂Emetine则通过抑制T细胞FasL表达而抑制了Hp介导的T细胞凋亡。结论 cagA蛋白及Hop38能通过调节FasL表达造成T细胞耐受 ;尿素酶、外膜蛋白Hop2 5、Hop35和HpaA不会通过抑制T细胞而导致耐受机制的发生 ,因而可安全应用于疫苗研制。

幽门螺杆菌CagA蛋白的纯化与鉴定

目的 纯化幽门螺杆菌 (Hp)相对分子质量 (Mr)为 130× 10 3 (CagA)蛋白 ,为单抗及疫苗的研制打下一定基础。方法 用盐酸胍粗提、分子筛层析及凝胶洗脱法纯化Hp970 0 2株Mr 为 130× 10 3(CagA)蛋白并鉴定。用Westernblot方法分析 6 8例患者血清中Mr 为 130× 10 3 (CagA)蛋白的阳性率。结果 纯化蛋白Mr 为 130× 10 3 ,电泳纯 ,并保持良好的抗原性。有 43例患者血清能与纯化的Mr 为 130×10 3 (CagA)蛋白反应 ,其阳性率随着浅表性胃炎、萎缩性胃炎、消化性溃疡和胃癌的排列次序呈逐渐增高趋势。结论 Mr 为 130× 10 3 (CagA)蛋白与胃部疾病的严重性相关。

幽门螺杆菌毒力蛋白cagA基因敲除突变株构建及鉴定

目的:构建幽门螺杆菌(Hp)毒力蛋白cagA基因敲除突变株并进行鉴定。方法:采用基因打靶技术,从Hp 1004基因组扩增cagA基因的上、下游同源重组臂序列,从pACYC184质粒上扩增氯霉素(Cm)序列,通过融合聚合酶链式反应(PCR)技术获得cagA基因敲除打靶片段,克隆入载体pUCmT,得到打靶载体pUCmT-ΔcagA::Cm;再通过电转化法将pUCmT-ΔcagA::Cm质粒直接转入Hp 1004,氯霉素抗性平板筛选cagA基因敲除株并命名为Hp/ΔcagA::Cm;采用PCR进行鉴定,并用Hp/ΔcagA::Cm和Hp/cagA感染原代胃癌细胞,检测胞内cagA的表达和对细胞形态的影响。结果:融合PCR构建打靶片段长度为1794 bp,打靶载体转化Hp并筛选后,用cagA外侧引物PCR扩增Hp/ΔcagA::Cm和野生型Hp/cagA,产物长度分别为2150 bp和5014 bp;Hp/ΔcagA::Cm和Hp/cagA分别感染细胞后,细胞死亡数量多于感染Hp/ΔcagA::Cm突变株,差异有统计学意义(P<0.01);野生型Hp/cagA菌株及其感染细胞内cagA蛋白表达水平较Hp/ΔcagA::Cm突变型菌株及其感染细胞明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:成功构建Hp/ΔcagA::Cm突变株,并在感染细胞中得到验证,表明cagA蛋白对细胞有一定的毒性作用。

镇江地区H pylori的cagA基因及其3′可变区结构的变化

目的:评估镇江地区H pylori临床株的cagA基因阳性率、了解菌株CagA蛋白的可能分型、其羧端可变区EPIYA的数目以及与临床结果之间有无关联.方法:培养分离来自临床胃十二指肠疾病患者的H pvlori,提取基因组DNA,通过PCR方法检测H pylori cagA基因的状况.随机选择不同病种的cagA基因阳性(cagA^+)的PCR产物.通过转化质粒,进行cagA^+PCR产物测序,通过ExPASY-Tranlation软件获得cagA基因相应的CagA蛋白的氨基酸序列.国际标准株NCTC11637的cagA基因以及CagA蛋白序列通过搜索NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库获得.结果:60株H pylori临床株中,56例为cagA^+,阳性率达93.3%.20例测序的结果表明,CagA蛋白结构可分为2种类型,19株东亚型和1株西方型.所有19株东亚型均为Yamaoka分型的A型,所有20例菌株的EPIYA的数目均为3个,与临床结果无关联.结论:cagA基因阳性率在不同病种之间无差异.镇江地区H pylori临床株的CagA蛋白的一级结构,与日本、韩国菌株一样,主要为东亚型,其CagA蛋白羧端可变区EPIYA数目均为3个,与临床结果无关联.

幽门螺杆菌空泡细胞毒素与细胞毒素相关蛋白

研究证明幽门螺杆菌(Hp)是人类慢性B型胃炎的主要致病因素,与消化性溃疡密切相关,近年的研究提示Hp与胃癌的发生也有密切关系。关于Hp的致病机理还不是很清楚,现有的资料表明Hp分泌的毒素与其致病性有较密切的关系。本文就这一方面的研究作一简要综述。 1988年。

幽门螺杆菌cagA基因全长克隆及序列分析

目的 探索扩增cagA基因全长的PCR方法 ,克隆中国 2株胃癌幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori,Hp)分离株和1株十二指肠溃疡分离株及国际标准株SS1的cagA基因 ,初步探讨cagA序列和磷酸化位点变异及其临床意义。方法 针对已知cagA基因两侧及cag致病岛右侧反转重复序列设计PCR引物 ,扩增cagA基因并克隆测序 ,分析已知cagA序列同源性及其酪氨酸磷酸化位点。结果 3株中国Hp分离株cagA氨基酸序列的同源性约为 94% (93 9%、94%、94 5 % ) ,并都有pY117/118/12 2和EPIYA A、B、D 4个酪氨酸磷酸化位点。SS1株cagA与西方菌株同源性大于 85 % ,而与中国菌株的同源性小于 80 % ,具有pY117/118/12 2和EPIYA A、B、C 4个酪氨酸磷酸化位点。结论 建立的PCR方法可扩增cagA基因全长。CagA序列变异和磷酸化位点具有地区聚类特征 ,但与Hp感染临床结局无特殊关联。

CagA及其与幽门螺杆菌致病性的关系

现已公认,幽门螺杆菌(Helicobacter Pylori,HP)感染是引起消化性溃疡、慢性胃炎、胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤以及胃癌的重要原因。人群中Hp感染率很高,并且感染可持续数十年甚至终身,但大多数感染者为无症状携带者,小部分发生消化性溃疡,很少一部分发展为胃癌。宿主对HP免疫反应的差异可能是其中原因之一,Hp菌株的不同可能也是重要的一方面。近年发现有cagA基因的HP菌株具有更高的毒力,与胃、十二指肠疾病的关系更密切。

消化性溃疡患者Cag A蛋白及Gas的水平变化特点及诊断学价值分析

目的:探究消化性溃疡患者CagA蛋白及Gas的水平变化特点,评价两种因子对于消化性溃疡的诊断学价值。方法:选取2016年1月-2017年6月我院消化科收治的128例良性消化道疾病患者为观察组,检测各受试者血清CagA蛋白表达阳性率及血清Gas水平均值,并以大于所有受试者血清Gas浓度中位数为阳性限,后经胃镜确诊128例患者中胃溃疡35例,十二指肠溃疡45例,慢性胃炎48例,统计各类病变患者CagA蛋白表达阳性率及血清Gas阳性率,分析CagA蛋白阳性表达和血清Gas阳性表达两个指标对消化性溃疡诊断的敏感性及特异性。结果:在128例消化性溃疡患者中,94例血清CagA检测呈阳性,敏感性为73.43%(94/128),在健康体检者中,104例血清CagA检测呈阴性,特异性为81.28%(104/128),消化性溃疡患者血清Gas浓度均值为(56.89±9.24)ng/L,显著高于对照组(40.68±8.27)ng/L。选取所有受试者血清Gas浓度中位数46.50ng/L为阳性,对消化性溃疡诊断的敏感性为79.68%(102/128),特异性为83.59%。结论:消化性溃疡患者血清CagA阳性表达率和Gas水平均显著高于健康人群,两项指标在消化性溃疡诊断中均具有较高的敏感性和特异性。

用噬菌体展示技术筛选幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白基因结合蛋白的研究

目的筛选幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白(CagA)基因结合蛋白,探索CagA致病机理。方法应用噬菌体展示技术,以幽门螺杆菌CagA基因片段作为固相筛选分子,对噬菌体人胃细胞cDNA文库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"富集,噬斑裂解液PCR扩增后,进行DNA序列分析和同源性生物信息学搜索,确定编码结合蛋白的种类。结果噬菌体经富集后,筛选出36个阳性克隆,构建了克隆载体。序列测定后经过同源性搜索,确定幽门螺杆菌CagA基因共编码核纤层蛋白B1和胰岛素样生长因子结合蛋白2两种已知蛋白。结论用噬菌体人胃cDNA文库筛选得到幽门螺杆菌CagA基因DNA结合蛋白,为研究CagA致病机理,幽门螺杆菌疫苗的研制和治疗等提供依据。