牛分枝杆菌ESAT-6基因和CFP-10基因在大肠杆菌中的融合表达

以牛分枝杆菌Vallee株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得了ESAT-6和CFP-10两个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术(SOE)将ESAT-6基因和CFP-10基因通过(G1y4Ser)3接头连接,得到了融合基因。将融合基因片段先克隆于pMD18-T载体,再亚克隆到表达载体pET32a(+)中,通过限制性内切酶消化、菌液PCR鉴定、序列分析证实得到含预期序列的重组质粒pET-ESAT-6-CFP-10;该质粒转化BL21(DE3);经IPTG诱导,表达出了40ku的融合蛋白;用Ni螯合层析方法纯化该蛋白,经SDS-PAGE检测,出现了清晰的单一条带;Western-blotting试验结果显示,该融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应。结果表明,ESAT-6基因和CFP-10基因在大肠杆菌中融合表达成功并具有良好的反应原性。

γ干扰素诱导蛋白-10的硫氧还基因融合表达、纯化及生物活性检测

γ干扰素诱导蛋白-10是由γ干扰素刺激单核细胞、内皮细胞等所诱导产生趋化T淋巴细胞的一类分泌性糖蛋白。本研究PCR扩增人与鼠γ干扰素诱导蛋白-10的成熟蛋白编码区,克隆到硫氧还载体pET-32(a)进行诱导表达。SDS-PAGE分析显示:在IPTG诱导下,人与鼠的γ干扰素诱导蛋白-10表达量约占目标总蛋白的25.3%,主要以包含体的形式存在,可溶性成分约占目标总蛋白的20%。将可溶性蛋白以S-Tag亲和层析柱进行纯化,纯化的蛋白质纯度约为90%的γ干扰素诱导蛋白-10。通过趋化性分析,证实重组表达的人与鼠γ干扰素诱导蛋白-10在100ng/ml浓度下对激活的T淋巴细胞具有趋化活性。

ESAT6-CFP10融合蛋白基因的克隆及其在耻垢分枝杆菌中的表达

目的:构建能表达ESAT6-CFP10融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌疫苗。方法:以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,克隆cfp10基因,将其插入到pGEM-T-easy载体后与esat6基因连接,构建含有esat6和cfp10融合基因的重组载体pGEM-e6c10。酶切消化pGEM-e6c10重组质粒,将esat6-cfp10基因亚克隆到pDE22分泌表达穿梭载体,以电穿孔方法将重组质粒转化至耻垢分枝杆菌。PCR筛选到的阳性克隆经温度诱导后,SDS-PAGE和Western印迹检测表达蛋白的正确性。结果:可表达出相对分子质量约23000的ESAT6-CFP10融合蛋白。Western印迹证明重组蛋白有较好的免疫原性。结论:获得能表达ESAT6-CFP10融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌,为结核病的预防奠定了一定的基础。

结核分枝杆菌esat6-cfp10融合基因的克隆表达及纯化

获得esat6-cfp10重组蛋白,为研究其在结核病诊断和预防中的作用奠定一定基础。以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,克隆cfp10基因,将其插入到pGEM-7ZF(+)克隆载体后与esat6基因连接,构建含有esat6和cfp10融合基因的克隆载体pGEM-e6c10。酶切消化pGEM-e6c10重组质粒,将esat6-cfp10基因亚克隆到pPROEXTM HTb原核表达载体,经IPTG诱导后,可表达出分子量约28 kD的esat6-cfp10融合蛋白,重组蛋白经镍柱纯化后,得到了高纯度的esat6-cfp10融合蛋白。Western blot证明表达重组蛋白有较好的免疫原性。

结核分枝杆菌cfp10-esat6融合基因原核表达载体的构建及表达

构建结核分枝杆菌cfp10-esat6融合基因及其原核表达载体,在大肠杆菌中表达融合蛋白CFP10-ESAT6。用基因拼接(GeneSOEing)法扩增cfp10-esat6融合基因,并将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒pGcfp10-esat6。重组子经限制性内切酶分析、聚合酶链式反应及测序鉴定后转化宿主菌大肠杆菌BL21,IPTG(isopropy-β-D-thiogalactoside,异丙基硫代-β-D半乳糖苷)诱导表达约42kDa带谷胱苷肽硫转移酶(Glutathione-S-TransferasesGST)蛋白标签的rCFP10-ESAT6融合蛋白,经谷胱苷肽硫转移酶融合蛋白纯化试剂盒得到纯化的融合蛋白,产物进行SDS-PAGE电泳、Western-blot鉴定。重组质粒pGcfp10-esat6中目的基因测序结果与报道序列相同;在大肠杆菌中以可溶性非包涵体形式表达;表达量约占菌体总蛋白的40%,表达蛋白纯化后获得纯度为90%左右的重组蛋白;Western印迹结果证实重组蛋白与确诊的结核病患者血清发生特异免疫反应。本研究成功构建了原核表达载体pGcfp10-esat6,获得了rCFP10-ESAT6融合蛋白,为rCFP10-ESAT6融合蛋白在结核病诊断中的应用奠定了基础。

IL-10-HGF融合基因对肝星状细胞LX-2增殖的抑制作用

目的探讨人白介素-10(IL-10)与人肝细胞生长因子(HGF)融合基因对肝星状细胞LX-2增殖的抑制作用。方法采用PCR方法,分别构建pcDNA3.1-flag-IL-10、pcDNA3.1-flag-HGF与pcDNA3.1-flag-IL-10-HGF真核表达载体,瞬时转染肝星状细胞LX-2;利用RT-PCR和Western blot检测LX-2细胞中IL-10、HGF的表达;选用MTT法检测转染24、48和72 h后LX-2细胞的增殖情况。结果成功构建了IL-10-HGF融合基因真核表达载体pcDNA3.1-flag-IL-10-HGF。与pcDNA3.1-flag-IL-10和pcDNA3.1-flag-HGF组比较,pcDNA3.1-flag-IL-10-HGF融合组48 h和72 h LX-2细胞数减少(n=3,P<0.05)。结论 IL-10-HGF融合基因可有效抑制肝星状细胞LX-2的增殖。

牛分枝杆菌cfp10-esat6-cfp7融合基因的原核表达及抗原反应性分析

为了增强单个蛋白在牛结核病诊断中的敏感性和抗感染中的免疫原性,试验采用重叠延伸PCR将牛分枝杆菌cfp10基因与esat6基因融合,得到cfp10-esat6融合基因,再行重叠延伸PCR将cfp10-esat6融合基因与cfp7基因融合,得到融合基因cfp10-esat6-cfp7,并克隆至T-Vector pMD19中,构建重组质粒pMD-cfp10-esat6-cfp7。对pMD-cfp10-esat6-cfp7和pET-28a(+)进行BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切,将纯化的cfp10-esat6-cfp7连接到pET-28a(+)中,获得表达质粒pET-cfp10-esat6-cfp7,通过IPTG诱导,SDS-PAGE分析表达质粒在E.coli BL21(DE3)中的表达情况。对表达的融合蛋白进行镍柱纯化,通过Western-blot和间接ELISA分析其抗原反应性。结果表明:获得了融合基因cfp10-esat6-cfp7,表达了约36.3 ku的融合蛋白CFP10-ESAT6-CFP7。融合蛋白CFP10-ESAT6-CFP7与10份牛结核阳性血清反应的OD492值均在0.6以上,而融合蛋白CFP10-ESAT6与阳性血清反应的OD492值在0.1~0.3之间;融合蛋白CFP10-ESAT6-CFP7与10份牛结核阴性血清的OD492值也明显高于CFP10-ESAT6,其与牛结核阳性血清呈现良好的反应性。说明CFP10-ESAT6-CFP7融合蛋白具有作为牛结核病诊断抗原用于新型疫苗研究的潜在价值。

细胞因子HGF、IL10及其融合基因的研究进展，

近年来，随着分子生物学技术的迅猛发展，使参与疾病发生和发展的众多因素得以发现和阐明，细胞因子在多种疾病发生和发展中所起的作用、担任的角色已经普遍被人们所共识。细胞因子（cytokifie，CK）是机体免疫细胞和非免疫细胞产生并分泌的糖蛋白生物活性分子，

CALM-AF10与急性白血病关系的研究进展

CALM-AF10所致的急性白血病罕见,且预后极差。CALM编码蛋白是介导细胞内吞作用的接合蛋白,参与细胞内吞和核内蛋白作用。AF10编码蛋白的功能可能是转录因子,可与MLL、CALM等多种基因融合。CALMAF10导致的白血病临床表现为肝脾大、纵隔肿瘤、中枢神经系统白血病等,对常规化疗药物不敏感或早期复发,预后不良。本文就CALM、AF10的结构和功能,CALM-AF10导致白血病发生的特点及可能的机制进行综述。

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达

目的 在大肠杆菌中高效融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT 6和CFP 10 ,获得纯化的重组ESAT6 CFP10 (rCFP10 ESAT6 )融合蛋白抗原。方法 通过聚合酶链反应 (polymerasechainreaction ,PCR)扩增CFP10 ESAT6融合基因 ;以质粒pET 2 8a为表达载体 ,构建重组质粒 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ;以异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达目的蛋白 ,通过SDS PAGE电泳和蛋白免疫印迹法 (Westernblotting)鉴定rCFP10 ESAT6在大肠杆菌中的表达 ,确定rCFP10 ESAT6蛋白抗原在大肠杆菌中的表达形式 ;采用ChelatingSepharoseFastFlow蛋白纯化试剂纯化重组蛋白。West ernblotting及酶联免疫吸附试验 (ELISA)分析重组蛋白的免疫原性。结果 重组质粒pET2 8a CFP10 ESAT6中目的基因测序结果与报道序列相同 ;在大肠杆菌中以可溶性形式表达 ;分子量约2 8kDa ,表达量约占菌体总蛋白的 4 6 % ,纯化后的rCFP10 ESAT6样品经SDS PAGE和激光密度扫描分析表明其纯度为 90 %左右 ,每 10 0ml培养菌可获得 16mg左右的重组蛋白 ;Western印迹结果证实重组蛋白与His·tag单克隆抗体及确诊的肺结核病患者血清发生特异免疫反应。ELISA结果分析表明 ,该重组抗原能区分肺结核患者血清及正常人血清。

结核分枝杆菌lhp-esat6融合基因原核表达载体的构建和表达

目的 :构建结核分枝杆菌 (MTb) 1hp -esat6融合基因及其原核表达载体并进行表达。方法 :用GeneSOEing法 ,将1hp基因和esat6基因体外重组 ,构建融合基因 ,克隆入pQE30质粒中进行表达。 结果 :构建的融合基因经测序证实完全正确 ,重组体转化表达菌DH5α后 ,经过IPTG诱导 ,表达出 2 6kDa左右的CFP10 -ESAT6融合蛋白。SDS -PAGE分析显示 ,IPTG诱导 4h表达量最高 ,表达蛋白以可溶性非包涵体形式存在于胞浆中 ,表达量占全菌蛋白质的 4 0 % ,Westernblotting证实其有良好的抗原性。表达蛋白经过Ni-NTA柱纯化后 ,获得了纯度为 98%的重组蛋白。结论 :成功构建MTblhp -esat6融合基因 ,成功构建原核表达载体pQE30 -CFP10 -ESAT6 ,并获得重组CFP10 -ESAT6融合蛋白 ,为MTb重组抗原的应用奠定了基础。

结核分枝杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白对小鼠巨噬细胞自噬功能的影响

目的研究结核分枝杆菌(MTB)ESAT6-CFP10融合蛋白对小鼠巨噬细胞自噬功能的影响。方法H37Rv菌株感染小鼠巨噬细胞后加入纯化的重组ESAT6-CFP10融合蛋白,通过透射电镜检测自噬体的形成。提取细胞总RNA和蛋白,以实时定量RT-PCR及Western blot方法检测自噬相关基因(atg)分子水平和蛋白表达水平。结果ESAT6-CFP10融合蛋白可抑制小鼠巨噬细胞自噬体的形成,并导致atg分子表达水平下降,其中atg8表达量下降最为明显。结论MTB ESAT6-CFP10融合蛋白通过调控atg分子表达水平影响小鼠巨噬细胞自噬功能。

原发性t(10;11)易位白血病CALM和AF10融合转录检测及其体外化疗敏感性分析

为了研究CALM和AF10融合转录在原发性t( 10 ;11)易位白血病形成和治疗中的作用 ,采用RT PCR技术检测了 5例原发性t( 10 ;11)易位白血病患者CALM AF10融合转录 ,体外MTT法检测了其白血病细胞体外化疗敏感性。结果表明 :在 5例原发性t( 10 ;11)易位白血病患者中检测到 5种分子量的AF10 CALM融合转录和 4种分子量的CALM AF10融合转录 ;MTT法显示 5例原发性t( 10 ;11)易位白血病患者的白血病细胞有 2例对体外化疗敏感 ( 60 % ) ,3 6例非t( 10 ;11)易位白血病细胞有 3 1例对体外化疗敏感 ( 86% ) ,统计分析有显著差异 (P <0 0 1) ,与临床治疗结果一致。化疗药物处理 72小时 ,t( 10 ;11)白血病细胞的凋亡率为 ( 16.3 7± 2 .5 6) % ,而非t( 10 ;11)白血病细胞的为 ( 3 3 .75± 5 .5 9) % ,差异有显著性 (P <0 .0 1)。结论 :CALM AF10是t( 10 ;11)易位白血病的常见特点之一 ,可能与该白血病发生密切相关 ,且t( 10 ;11)易位白血病患者预后较差。

HA20-lys10在大肠埃希菌中的融合表达纯化和凝胶阻滞试验

目的 表达和纯化流感病毒血凝素HA2氨基末端20个氨基酸与10个赖氨酸的融合蛋白HA20-lys10,并观察其与质粒结合的能力。方法 用PCR方法构建流感病毒血凝素HA2氨基末端20个氨基酸与10个赖氨酸的融合基因HA20—lys10,并克隆于pET32a(+)原核表达载体。将重组表达质粒pET-HA-K转化大肠埃希菌BL21(DE3),当A(Abs)_(600nm)达到0.6时,加入终浓度为1mmol/L IPTG诱导目的蛋白的表达。表达产物用亲和层析一步法进行纯化,然后用凝胶阻滞试验观察重组蛋白结合质粒的能力。结果 IPTG诱导后可获得相对分子质量约为27 000的目的蛋白,表达蛋白以可溶形式存在,占菌体蛋白20％以上。表达菌超声后,表达产物经亲和层析一步纯化后可获得纯度达85％以上目的蛋白。凝胶阻滞试验发现,纯化的重组蛋白在一定条件下可以与质粒结合,使质粒的迁移率明显改变。结论 融合蛋白HA20—lys10有望用于受体介导基因转移,以提高基因转移的效率。

重组ACTH(4-10)与GDNF融合蛋白及其生物活性研究

通过PCR方法构建了促肾上腺皮质激素 4 10 (ACTH (4 10 ) )与胶质细胞源性神经营养因子 (GDNF)的融合基因 ,并将它重组克隆到表达载体 pET 2 8a (+ )中 ,构建表达质粒pET ACTH (4 10 ) GDNF ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,经IPTG诱导可高效表达ACTH (4 10 ) GDNF融合蛋白 .用Ni2 + NTA树脂一步法纯化目的蛋白 ,纯度达 85 %以上 .纯化和复性的ACTH (4 10 ) GDNF融合蛋白能显著促进脊髓神经元存活 ,作用强于ACTH (4 10 )及GDNF蛋白 .

CALM/AF10反义核酸对原代CALM/AF10融合转录白血病细胞的体外作用分析

目的 :确定 CALM和 AF1 0融合转录在原发性 t( 1 0 ;1 1 )转换的白血病形成和治疗中的作用。方法 :检测 5例原发性 t( 1 0 ;1 1 )转换的白血病患者 CAL M- AF1 0融合转录 ,检测 CALM/AF1 0硫代反义核酸对其白血病细胞体外化疗敏感性和凋亡的作用。结果 :RT-PCR在 5例原发性 t( 1 0 ;1 1 )转换的白血病患者中检测到 5种分子量大小的 AF1 0 - CALM融合转录和 4种分子量大小的 CAL M- AF1 0融合转录。原代 t( 1 0 ;1 1 )转换的白血病细胞对体外化疗敏感性较非 t( 1 0 ;1 1 )转换的显著低 ,而 AS- PS- ODNs增加了其体外化疗敏感性和凋亡率。5μM AS- PS- ODNs处理时有 4例阳性 ,1 0μM和 2 0μM AS- PS- ODNs处理时 5例全阳性 ,而单纯化疗药组和化疗药 + 1 0μM正义硫代核酸 ( S- PS- ODNs)组分别只有 3例。化疗药+ 1 0μM AS- PS- ODNs处理 48h、72 h、96h后 ,细胞凋亡指数分别显著高于单纯化疗药组和化疗药 + 1 0μM S- PS- ODNs组。而单纯化疗药组和化疗药 + 1 0μM S- PS- ODNs组间凋亡指数在对应时间无差别。结论 :CALM- AF1 0与 t( 1 0 ;1 1 )转换白血病的发生密切相关 ,且 t( 1 0 ;1 1 )转换的白血病患者预后较差。

1例伴孤立性i(17)(q10)染色体异常的急性早幼粒细胞白血病

伴孤立性i（17）（q10）染色体异常的急性早幼粒细胞白血病（APL）临床极为少见,在国内也鲜有报道,其临床意义还不明确,现分析1例伴单纯i（17）（q10）染色体异常APL的临床特征、实验室检测及治疗预后情况,进一步探讨APL患者该类染色体异常的临床意义。