CaM激酶及其在植物体内的功能

介绍CaM激酶的结构和生化特点以及植物体内CaM激酶的研究进展。从植物细胞信号转导、发育和基因表达等 3个方面讨论了CaM激酶在植物体内的生理功能。

水稻叶片Ca^(2+)/CaM依赖性蛋白激酶的纯化和活性测定

通过高速离心、( NH4) 2 SO4沉淀、琼脂糖凝胶过滤和 Ca M- sepharose4B亲和层析 ,从 HPGMR( 5 8S)叶片中初步纯化出 Ca2 + / Ca M依赖性蛋白激酶 .纯化的 Ca2 + / Ca M依赖性蛋白激酶经 SDS-聚丙烯酰胺凝胶线性梯度电泳 ,亚基分子量约为 5 5× 10 3.在 Ca2 + / Ca M依赖性蛋白激酶的标准反应体系中 ,存在过量的 ATP,提取磷酸化反应剩余的 ATP,用叶绿体 Mg2 + - ATP酶分解 ATP,最后用复合孔雀绿测定无机磷 ,从而来计算 Ca2 + / Ca M依赖性蛋白激酶的活性 .实验结果表明 ,该酶活性是依赖 Ca2 + 和 Ca M的 ,并且 EGTA和

PTSD大鼠杏仁核CaMKIIα及pCaMKIIα表达的变化

目的观察创伤后应激障碍(PTSD)样行为异常大鼠杏仁核神经元CaM依赖性蛋白激酶IIα(CaMKIIα)及磷酸化CaM依赖性蛋白激酶IIα(pCaMKIIα)表达变化。方法采用国际认定的SPS方法刺激建立大鼠PTSD模型,取成年健康雄性Wistar大鼠75只,随机分为SPS模型的12h、1d、4d、7d组及正常对照组,采用免疫组织化学、免疫印迹法检测大鼠杏仁核CaMKIIα及pCaMKIIα的表达变化。结果SPS刺激后大鼠杏仁核神经元细胞内CaMKIIα于12h开始减少,1d表达最少,4d开始逐渐增多,至7d时基本恢复正常;pCaMKIIα的表达则于SPS12h开始增多,1d时表达最多,4d时开始减少,至7d时基本恢复正常。CaMKIIα阳性细胞在SPS各组模型均出现,1d表达最少。结论杏仁核CaMKIIα及pCaMKIIα的表达变化,可能是PTSD大鼠情感行为异常的重要病理生理基础之一。

Ca^（2＋）／CaMPKⅡ与脑缺血兴奋毒性关系的研究

采用大鼠海马脑片体外缺血模型，观察了“缺血”或谷氨酸及氯胺酮对海马脑片Ｃａ￣（２＋）／ＣａＭＰＫⅡ活性的影响，同时观察了缺血对神经元胞外谷氨酸堆积的影响。结果如下：（１）Ｃａ￣（２＋）／ＣａＭＰＫⅡ活性随“缺血”时间的延长而逐渐下降，缺血１０，２０和３０ｍｉｎ，酶活性分别为对照组的６３％，４４％和２９％（１０ｍｉｎ，Ｐ＜０．００２；２０和３０ｍｍ，Ｐ＜０．００１），提示该酶对缺血非常敏感。（２）单纯过量外源性谷氨酸作用３０ｍｉｎ，能引起酶活性显著下降到仅为对照组的２４％，提示脑缺血时酶活性的抑制与兴奋毒性有关。（３）海马脑片在体外缺血３０ｍｉｎ时，谷氨酸在胞外的堆积增加２倍多（从１２８±２０升高到４３１±７４ｎｍｏｌ·ｍｇ￣（－１）ｐｒｏ·ｍｉｎ￣（－１），ｎ＝６）。（４）氯胺酮对“缺血”和单纯外源性谷氨酸所诱导的酶活性抑制均有明显的拮抗作用，但其拮抗作用显著不同，前者可使酶活性恢复至对照的６２％，后者高达９２％。说明脑缺血引起酶活性下降不仅与ＮＭＤＡ受体有关，而且与其它因素有关。

CaMKⅡ和SynGAP在大鼠脑缺血中的神经保护作用

目的:研究脑缺血诱导的SynGAP丝氨酸磷酸化、CaMKⅡ与SynGAP的相互作用及内在机制。方法:利用大鼠四动脉结扎全脑缺血模型,通过免疫沉淀和免疫印迹的手段观察CaMKⅡ自身磷酸化、从胞浆转位到胞膜以及SynGAP的丝氨酸磷酸化,并利用脑室注射CaMKⅡ的特异性抑制剂观察上述指标的变化。结果:脑缺血导致胞膜部分总的CaMKⅡ和磷酸化的CaMKⅡ的水平均显著升高,CaMKⅡ与SynGAP的结合显著高于对照组,SynGAP的丝氨酸磷酸化水平也显著升高;CaMKⅡ的抑制剂KN62能抑制CaMKⅡ的自身磷酸化、SynGAP的丝氨酸磷酸化以及CaMKⅡ和SynGAP的相互结合,但对胞膜CaMKⅡ的水平没有影响。结论:脑缺血诱导的SynGAP丝氨酸磷酸化是由CaMKⅡ所催化的,SynGAP发生丝氨酸磷酸化后导致激活MAPK信号通路,在缺血过程中可能为一种细胞应激反应,对神经元起保护作用。

低温缺血-再灌注对离体大鼠心房肌Kir2.1和CaMKⅡ表达的影响

目的探讨再灌注房性心律失常心房肌复极时程延长的分子机制。方法采用随机数字表法将16只由雄性SD大鼠制备的Langendorff离体心脏灌注模型分为对照组(C组,n=8)和低温缺血-再灌注组(IR组,n=8)。根据再灌注后是否发生房性心律失常,将IR组进一步细分为再灌注非房性心律失常亚组(N-RAA组)和再灌注房性心律失常亚组(R-AA组)。C组使用37℃K-H液平衡灌注120 min。IR组使用37℃K-H液平衡灌注30 min后停止,注射4℃Thomas液(20 mL/kg)使心脏停跳60 min,停跳30 min时使用半量4℃Thomas液(10 mL/kg)对离体心脏进行复灌[停跳期间用低温Thomas液(4℃)对心脏进行保护],后再次灌注37℃K-H液30 min。记录平衡灌注30 min(T_(0))、平衡灌注105 min/再灌注15 min(T_(1))和平衡灌注120 min/再灌注30 min(T_(2))时右心房单相动作电位(MAP),测量单相动作电位复极50%和90%的时程(MAPD_(50)和MAPD_(90))。电生理指标监测完后用Western blot检测右心房组织内向整流钾通道2.1(Kir2.1)和Ca^(2+)/CaM依赖激酶Ⅱ(CaMKⅡ)的表达。结果与T_(0)时点比较,R-AA组T_(1)、T_(2)时MAPD_(50)、MAPD_(90)明显延长(P<0.05);与C组比较,R-NAA组和R-AA组T_(1)、T_(2)时MAPD_(90)明显延长(P<0.05);与R-NAA组比较,R-AA组T_(1)、T_(2)时MAPD_(50)、MAPD_(90)明显延长(P<0.05)。Western blot结果显示,R-NAA组和R-AA组Kir2.1表达明显少于C组(P<0.05),且R-AA组明显少于R-NAA组(P<0.05);R-NAA组和R-AA组CaMKⅡ表达较C组明显增加(P<0.05),且R-AA组CaMKⅡ表达较R-NAA组明显增加(P<0.05)。结论低温缺血-再灌注房性心律失常大鼠心房肌复极时程延长可能与Kir2.1表达下调和CaMKⅡ表达增加有关。

谷氨酸对培养的皮质神经元Ca^(2+)/CaMPKⅡ活性的影响

目的研究谷氨酸（Ｇｌｕ）对皮质神经元的损伤及对Ｃａ２＋／ＣａＭＰＫⅡ活性的影响。方法５００μｍｏｌ／ＬＧｌｕ作用１０ｍｉｎ，测Ｃａ２＋／ＣａＭＰＫⅡ及乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）活性。结果Ｃａ２＋／ＣａＭＰＫⅡ活性和正常对照相比下降４６．３％，１００μｍｏｌ／Ｌ氯胺酮几乎完全保护该酶活性；ＬＤＨ活性在１ｈ时无明显变化，２４ｈ时明显升高。结论（１）Ｇｌｕ对皮质神经元损伤致Ｃａ２＋／ＣａＭＰＫⅡ活性下降早于ＬＤＨ变化；（２）Ｃａ２＋／ＣａＭＰＫⅡ活性下降主要由ＮＭＤＡ受体介导，与非ＮＭＤＡ受体无关。

谷氨酸在模拟高原梭曼中毒性脑损伤的作用研究

目的 探讨谷氨酸 (Glutamicacid ,Glu)在缺氧复合梭曼中毒脑损伤的作用机制。方法 采用氨基酸分析和放免技术 ,研究高原缺氧、梭曼中毒单一与复合致伤后 1 2、2 4、4 8h脑组织Glu和CaM含量的变化以及钙 /钙调蛋白激酶Ⅱ (Ca2 +/CaM PKⅡ )活性的影响及其机制。结果 缺氧复合梭曼中毒组脑组织Glu、CaM含量在中毒后 2 4h明显高于单纯中毒组、缺氧对照组和正常对照组 ;缺氧中毒组脑组织Ca2 +/CaM PKⅡ活性在中毒后 2 4h明显低于单纯中毒组、缺氧对照组和正常对照组 ;而N 甲基 D 天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂地佐环平 (MK 80 1 )和钙通道拮抗剂尼莫地平 (Nimodipine)可对抗这种改变。结论 高原缺氧复合梭曼中毒后Glu的兴奋毒引起脑损伤和Ca2 +/CaM PKⅡ的活性下降 ,主要由NMDA受体介导和胞外Ca2 +内流增加有关。

RNA结合基序蛋白20在心肌病中作用的研究进展

心肌病是异质性的心肌病变,表现为心肌结构和功能的异常,心肌病最终会导致心力衰竭甚至死亡。RNA结合基序蛋白20(RBM 20)在心肌中高度表达,是富含丝氨酸/精氨酸蛋白家族的一种,对RNA剪接体的组装和选择性剪接的调控过程起着重要作用,参与心肌病的发生、发展。RBM 20调控Titin、RyR 2、LDB 3、CaMKIIδ、CACNA1C等多种基因的选择性剪接,这些基因与心脏舒张功能、肌节组装、离子转运密切相关。该文将对RBM 20在心肌病中的作用和RBM 20调控机制进行综述,为心肌病的防治提供相应的理论参考。

血管性痴呆病因病机与发病机制研究概况

血管性痴呆(vascular dementia,VD)属中医学"呆病"、"痴证"等范畴,为肾精亏虚-髓海不足、痰、浊(水湿)-瘀血等蒙蔽(阻)脑窍、玄府郁阻、浊毒内侵、本虚标实、气血亏虚、三焦气化失司、伏邪内生-损害元神、脏腑功能失调、络脉学说;病理机制包括中枢胆碱能、兴奋性氨基酸、氧自由基、神经细胞凋亡、细胞和分子(海马Ca2+、钙调素CaM依赖性蛋白激酶Ⅱ-CaMPKⅡ,内皮素-1-ET-1降钙素)、炎性反应、遗传机制、危险等。中医虽然对血管性痴呆发病原因论述较多,但机理尚未明确,未能达成共识,亦有待于临床与实验进一步检验,对呆病诊断也需扩展其内涵。认为现代医学虽在科研上取得一些研究成果,但也存在一定问题,未来应统一实验标准、设计严谨科研方案等,指导临床VD治疗,判断治法方药优劣性及稳定性。

舒郁胶囊对PMDD肝气郁证模型大鼠Cav1.2介导的CaM/CaMKⅡ信号通路的影响

目的：观察舒郁胶囊对强迫游泳应激诱导的经前烦躁障碍（premenstrual dysphoric disorder,PMDD）肝气郁证大鼠的影响,探讨L型钙通道（L-type calcium channel,LTCC）Cav1.2亚型介导的钙调蛋白（CaM）/CaMKⅡ信号通路在PMDD肝气郁证发生中的机制。方法：动情周期规律的大鼠进行3次强迫游泳实验,筛选出48只雌性Wistar大鼠进入实验,两次非接受期和接受期悬浮不动时间差值绝对值平均值最小的12只为正常组,其余36只分为模型组、舒郁胶囊组（0.408 g·kg^-1·d^-1）,氟西汀组（2.7 mg·kg^-1·d^-1）。给药组连续给药2个动情周期,模型组和正常组给以等量纯水。采用旷场实验、强迫游泳悬浮不动时间及悬浮不动次数评价模型和药物干预效果。免疫荧光、实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）和蛋白质免疫印迹（Western blot）检测各组大鼠海马脑区中L型钙通道α1C亚型（CACNA1C）,CaM依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）的分布及表达。结果：CACNA1C蛋白主要分布在细胞膜上,CaMKⅡ蛋白主要分布在的细胞质内;与正常组比较,模型组大鼠体质量、旷场总路程显著下降（P〈0.05,P〈0.01）,强迫游泳悬浮不动时间、悬浮不动次数显著升高（P〈0.05,P〈0.01）,海马脑区细胞排列散乱,CACNA1C和CaMKⅡ表达升高（P〈0.05,P〈0.01）;与模型组比较,氟西汀和舒郁胶囊组大鼠体质量、旷场总路程明显升高（P〈0.05,P〈0.01）,强迫游泳悬浮不动时间、悬浮不动次数明显降低（P〈0.05,P〈0.01）,海马脑区细胞排列整齐,CACNA1C和CaMKⅡ表达明显降低（P〈0.05,P〈0.01）。结论：利用强迫游泳可成功诱导出PMDD肝气郁证大鼠模型。舒郁胶囊可能通过Cav1.2介导的CaM/CaMKⅡ信号通路发挥治疗作用,显著改善PMDD肝气郁证大鼠的行为学变化。

基于“肝肾相关”理论从Ca2+-CaM/CaMKⅡ-CREB信号转导途径探析黑逍遥散防治阿尔茨海默病的可行性

阿尔茨海默病(AD)是一种起病隐匿的增龄性神经退化性疾病,随着社会老龄化发展趋势而迅猛增加,严重威胁着人民群众健康,如果缺乏有效防治措施,将给社会经济和医疗保障体系造成巨大冲击。研究发现细胞信号转导异常是许多疾病发生的关键环节,细胞信号转导理论被广泛应用于阐明中医脏象实质和中医药作用机制的研究。"肝肾相关"是"五脏相关"理论的核心板块之一,适用于复杂疾病发病机制的阐释,解释多证候的相关性,及指导临证处方用药。黑逍遥散作为本研究组基于肝肾相关理论防治AD的首选复方,可通过疏肝养血、健脾益肾,通脑络利神窍而发挥防治AD作用。本文基于"肝肾相关"理论,从中医学角度阐述了AD的发病机制,通过查阅文献并结合前期研究,提出了从Ca2+-钙/钙调蛋白依赖性蛋白(CaM)/钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)-环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)细胞信号转导途径防治AD的方法与思路。