基于cAMP-PKA-CREB信号通路中药防治血管性痴呆的研究进展

环磷酸腺苷(cAMP)-蛋白激酶A(PKA)-cAMP响应性元件结合蛋白(CREB)是神经系统一条重要的信号途径,在血管性痴呆(Va D)的防治方面发挥重要作用。中医药是我国治疗Va D的重要手段,其主要优势在于保护脑血管、改善学习记忆与认知功能的效果显著且无明显不良反应。本文基于cAMP-PKA-CREB信号通路在脑血管病变和记忆认知功能方面的调节机制,从单味中药及中药复方的角度综述了中药防治Va D的作用机制,为今后Va D相关基础及临床研究提供理论依据。

基于VIP-cAMP-PKA-AQP3信号通路探讨益气润肠方治疗气虚型便秘大鼠的作用机制

目的:基于VIP-cAMP-PKA-AQP3信号通路探讨益气润肠方对气虚便秘模型大鼠作用及其机制。方法:选取48只SD大鼠随机分为空白组、模型组、乳果糖组、益气润肠方低剂量组、益气润肠方中剂量组和益气润肠方高剂量组,每组8只。空白组大鼠正常饮食,每日给予生理盐水灌胃,其余大鼠给予洛哌丁胺混悬液3 mg/(kg·d)灌胃加饥饱饮食2周制作气虚便秘模型。造模成功后,空白组及模型组每日给予生理盐水灌胃,乳果糖组给予乳果糖口服溶液1.67 g/(kg·d)灌胃,益气润肠方高、中、低剂量组分别给予益气润肠方17.5、8.75、4.375 g/(kg·d)灌胃,连续2周。14 d后称量大鼠粪便湿重、粪便干重并计算粪便含水率;留取结肠组织,采用苏木精伊红染色法观察结肠病理变化,qPCR检测大鼠结肠血管活性肠肽(VIP)、环磷酸腺苷(cAMP)、蛋白激酶A(PKA)、水通道蛋白3(AQP3)mRNA表达水平,Western blot检测大鼠VIP、AQP3蛋白表达水平。结果:与空白组比较,模型组大鼠体质量明显降低(P<0.01),粪便湿重及粒数明显减少(P<0.01);与模型组比较,益气润肠方低、中、高剂量组和乳果糖组体质量明显增高(P<0.01,P<0.05),粪便湿重增加、粪便粒数增多(P<0.05,P<0.01),但粪便含水率无统计学意义(P>0.05)。与乳果糖组比较,益气润肠方中、高剂量组粪便湿重明显增加、粪便粒数显著增多(P<0.05)。与空白组比较,模型组VIP、cAMP、PKA、AQP3 mRNA表达水平明显降低(P<0.01,P<0.05);与模型组比较,乳果糖组及益气润肠方各剂量组VIP、cAMP、PKA、AQP3 mRNA表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01),益气润肠方高剂量组效果最显著(P<0.01),且优于乳果糖组(P<0.05)。与模型组比较,益气润肠方各剂量组VIP、AQP3的蛋白表达水平升高,且呈剂量依赖性(P<0.05)。益气润肠方可以明显改善咯派丁胺造成的便秘大鼠的肠道病理形态损害。结论:益气润肠方可通过调控VIP-cAMP-PKA-AQP3通路治疗大鼠气虚型便秘。

血管活性肠肽对便秘大鼠排便及结肠组织中VIP-cAMP-PKA-AQP3信号通路的影响

目的:观察血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)对便秘大鼠肠道水液代谢、环磷酸腺苷-蛋白激酶A信号通路(cyclic AMP protein kinase A signaling pathway,c AMP-PKA)和水通道蛋白3(water channel protein 3,AQP3)的影响,探讨VIP治疗便秘的作用及机制。方法:45只健康成年Sprague-Dawley大鼠随机分为空白对照组、模型组、模型+VIP组。给药4周后,墨汁灌胃法检测大鼠首粒黑便排出时间;根据大鼠粪便干湿重计算粪便含水率;HE染色观察各组大鼠结肠组织形态学变化;Western印迹检测各组大鼠结肠组织中VIP和AQP3蛋白表达水平;定量即时聚合酶链锁反应(quantitative real time polymerase chain reaction,q PCR)检测各组大鼠结肠组织中c AMP,PKA和AQP3 m RNA的表达水平。结果:与空白对照组比较,模型组大鼠首粒黑便出现时间延长,粪便含水率明显减少(均P<0.01);结肠黏膜上皮部分破坏,杯状细胞体积减小,数量明显减少;结肠组织中VIP和AQP3蛋白含量明显减少,AQP3,c AMP和PKA m RNA相对表达水平均有所降低(均P<0.05)。与模型组比较,模型+VIP组大鼠首粒黑便出现时间缩短,粪便含水率明显增加(均P<0.05);结肠黏膜上皮完整性明显改善,杯状细胞体积增大,数量增多;结肠组织中VIP和AQP3蛋白含量增多,CAMP,PKA和AQP3 m RNA相对表达水平升高(均P<0.05)。结论:VIP静脉注射能够调节肠道水液代谢,改善大鼠便秘症状,其机制可能与调节VIP-c AMP-PKA-AQP3信号通路有关。

CCK-8抗炎作用中DAG-PKC信号通路对cAMP-PKA信号通路的影响

目的探讨CCK-8抗炎作用中DAG-PKC信号通路对cAMP-PKA信号通路的影响。方法分离纯化大鼠PIMs,分别用LPS、CCK、LPS+CCK、PMA、SC-3088、LPS+PMA、LPS+SC-3088、CCK+PMA、CCK+SC-3088、LPS+CCK+PMA、LPS+CCK+SC-3088孵育一定时间,采用125I-cAMP放射免疫分析法测定细胞内cAMP含量,用放射激酶法测定PKA活性。结果单独应用PMA和SC-3088孵育大鼠PIMs,细胞内cAMP含量和PKA活性与正常对照组相比无明显变化(P>0.05)。PMA可升高LPS作用下的细胞内cAMP含量和PKA活性(P<0.01),SC-3088则可使LPS作用下的细胞内cAMP含量和PKA活性降低(P<0.01)。分别应用PMA、SC-3088与CCK共同孵育,则CCK+PMA组细胞内cAMP含量和PKA活性高于单独应用CCK组(P<0.01),CCK+SC-3088组则降低(P<0.01)。与LPS+CCK组相比,PMA+LPS+CCK组细胞内cAMP含量和PKA活性升高(P<0.01),而SC-3088+LPS+CCK组细胞内cAMP含量和PKA活性降低(P<0.01)。结论在LPS诱导的大鼠PIMs,CCK-8可通过激活cAMP-PKA信号通路发挥抗炎作用;DAG-PKC信号通路的活化对cAMP-PKA信号通路有正性调节作用。

平胃散对湿阻中焦证模型胃体粘膜层AC-cAMP-PKA信号通路的影响

目的探讨平胃散如何影响湿阻中焦证模型动物胃体粘膜层AQPs表达及AC-cAMP-PKA信号转导途径,并揭示其可能存在的机理。方法采用综合法造模,通过免疫组化技术测定胃体粘膜层AQPs的表达,用酶联免疫法(ELISA)检测胃体粘膜层腺苷酸环化酶(AC)、环磷酸腺苷(cAMP)、蛋白激酶A(PKA)的表达差异。结果胃体粘膜层有AQP1,AQP2,AQP3,AQP4,AQP5,AQP7,AQP9这7种水通道蛋白表达,造模后,AQP2的表达下调;经过平胃散治疗后,AQP2,AQP9的表达上升。与空白组比较,模型组胃体粘膜层cAMP、AC的含量降低;与模型组相比,平胃散组胃体粘膜层cAMP、AC的含量升高。结论胃体粘膜层含有AQP1,AQP2,AQP3,AQP4,AQP5,AQP7,AQP9这7种水通道蛋白,ACcAMP在湿阻中焦证大鼠的胃体粘膜层的表达降低,平胃散可能通过调控水通道蛋白以及AC-cAMP途径防治湿阻中焦证的病变。

CCR2可能通过cAMP-PKA信号通路参与大鼠炎性疼痛

目的：探讨趋化因子受体2（chemokine receptor 2,CCR2）和c AMP-PKA信号通路在大鼠炎性疼痛发生及维持中的作用。方法：72只雌性大鼠随机分为假手术组,炎性疼痛组和CCR2抑制剂组,每组24只,各组大鼠分别采取不同处理措施,分别于处理前（T0）、注药后1 d（T1）、3 d（T2）、5 d（T3）和7 d（T4）时,对左侧后足底双足机械缩爪阈值（mechanical paw withdrawal threshold,MWT）进行测定;分别于处理后T2、T3和T4时,利用ELISA法测定背根神经节细胞中c AMP水平,利用荧光定量PCR检测CCR2、PKA和CREB在背根神经节中的表达,利用Western blot检测p CREB蛋白在背根神经节中表达。结果：与T0时相比,炎性疼痛组和CCR2抑制剂组大鼠T1-4时MWT均降低,差异均有统计学意义（P〈0.05）;炎性疼痛组和CCR2抑制剂组大鼠T1-4时MWT均低于假手术组,CCR2抑制剂组大鼠T1-4时MWT均高于炎性疼痛组,差异均有统计学意义（P〈0.05）;炎性疼痛组和CCR2抑制剂组大鼠T2-4时c AMP、CCR2 m RNA、PKA m RNA、CREB m RNA及p CREB蛋白表达量均高于假手术组,CCR2抑制剂组大鼠T2-4时c AMP、CCR2 m RNA、PKA m RNA、CREB m RNA及p CREB蛋白表达量均低于炎性疼痛组,差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论：背根神经节中CCR2在炎性疼痛发生及进展中发挥重要作用,CCR2可能通过c AMP-PKA信号通路而参与炎性疼痛的发生。

VIP-cAMP-PKA-AQP3信号通路与肺肠合治法治疗支气管哮喘的研究进展

肺肠合治法是中医临床治疗支气管哮喘的常用方法之一,中医的肺和大肠属于功能概念,包涵西医学的"肺"和"大肠",两脏在功能上相互联系,在治疗上相互为用,从系统生物学的角度,两者之间应当存在着共同的物质基础和相关的信号传导通路,但目前尚不十分清楚。文献研究表明,VIP-cAMP-PKA-AQP3信号通路既参与支气管哮喘(肺病)的发病,又在功能性便秘(肠病)的发病机制中发挥重要作用,VIP和AQP3既是治疗支气管哮喘的重要靶点,又是通肠泻下法治疗功能性便秘的作用靶点,这一结果提示该信号通路可能是肺与大肠之间相互联系的物质基础。本文以该通路为切入点,分析其在哮喘发病中的作用以及肺肠合治法对该通路的影响,以期为哮喘的治疗提供新的靶点。

基于cAMP-PKA信号通路的虚寒状态大鼠中枢神经递质变化机制研究

目的:探讨虚寒状态下单胺类神经递质的变化及机制,明确cAMP-PKA信号通路在虚寒状态中的作用。方法:氢化可的松塑造大鼠虚寒模型,HPLC法检测脑内单胺类神经递质及代谢产物含量:NE、E、DA、5-HT、5-HIAA、DOPAC,放免法测血浆cAMP、cGMP水平,免疫组化法测肝脏PKA表达。结果:14d虚寒状态组NE、5-HIAA、5-HT含量和cAMP、cGMP水平及PKA表达显著降低;21 d虚寒状态组NE、DOPACT含量和cAMP、cGMP水平及PKA表达显著降低。结论:cAMP-PKA通路可能是介导虚寒状态脑内单胺类神经递质变化的机制之一。

电针额区对血管性痴呆大鼠行为学及脑内cAMP-PKA-CREB信号通路的影响

目的:探讨电针额区对血管性痴呆(VD)大鼠脑内海马区c AMP-PKA-CREB信号通路的影响。方法:选取60只健康雄性老龄Wistar大鼠,随机分成假手术组、电针组、模型组和西药组,每组15只,共4组。动物模型的制作方法采用2-血管阻断法(2-VO),待大鼠伤口愈合后给予相关治疗。电针组选取VD大鼠头部额区的穴位神庭透至囟会,同时在此穴的基础上各旁开1寸及2寸(参照于致顺老师头穴分区法)给予丛刺,连接KWD-808 I型脉冲电疗仪,采用疏密波,2 Hz频率,电针20 min,之后再留针10 min,每日治疗1次,共30天。西药组给予脑复康治疗,假手术组和模型组给予生理盐水灌胃治疗。每组大鼠采用Morris水迷宫进行行为学能力的检测,并采用SABC法检测海马区c AMP的含量,同时采用免疫印迹法检测海马区PKA及CREB蛋白表达的变化。结果:与模型组比较,电针额区明显提高了VD大鼠Morris水迷宫的检测成绩,使海马区c AMP的含量升高,并显著增加PKA、CREB的阳性细胞数量(P<0.05);而电针组与西药组比较各指数无统计学意义(P>0.05)。结论:电针额区可以有效改善VD大鼠的记忆能力,提高其学习成绩,调整VD大鼠海马区c AMP-PKA-CREB信号通路的传导。

颗粒细胞增殖分化中卵泡刺激素的cAMP-PKA通路

卵泡刺激素(FSH)是一种重要的女性生殖激素,是由垂体前叶合成和分泌的一种糖蛋白激素。FSH与卵巢颗粒细胞膜上的特异性受体结合发挥生物学效应。卵泡刺激素受体(FSHR)属于G蛋白耦联受体超家族,与FSH结合后激活环磷酸腺苷(cAMP)/蛋白激酶A(PKA)通路下游区信号级联放大,促进颗粒细胞增殖分化和卵巢性激素的合成。

来曲唑通过cAMP-PKA信号通路影响子宫肌瘤细胞中MMP-2和TIMP-2的表达

目的探讨cAMP-PKA信号通路在来曲唑影响子宫肌瘤细胞中MMP-2和TIMP-2表达中的作用。方法cAMP-PKA信号通路抑制剂H-89(10μmol/L)处理原代培养的人子宫肌瘤细胞30 min后,来曲唑(10-8、10-7、10-6和10-5mol/L)处理24、48和72 h。采用实时定量PCR和Western blot分别检测MMP-2和TIMP-2 mRNA和蛋白的表达。结果来曲唑以浓度和时间依赖的方式下调了人子宫肌瘤细胞中MMP-2 mRNA和蛋白的表达,上调了TIMP-2 mRNA和蛋白的表达(P均<0.05)。H-89部分取消了来曲唑诱导的人子宫肌瘤细胞中MMP-2表达的下调和TIMP-2表达的上调(P均<0.05)。结论来曲唑通过cAMP-PKA信号通路影响子宫肌瘤细胞中MMP-2和TIMP-2的表达。

甲胎蛋白受体的性质及其所介导的cAMP-PKA信号转导途径

研究HeLa细胞膜上甲胎蛋白 (alpha fetoprotein ,AFP)受体的存在情况及其介导的信号转导 .先用Na[12 5I]标记AFP ;标记的AFP和培养的HeLa细胞结合 ,Scatchard法和受体 配体结合法分析受体数目 ;再用放射免疫结合法分析在百日咳毒素 (pertussistoxin ,PTX)预处理前后AFP对细胞内环腺苷酸 (cAMP)浓度及细胞内蛋白激酶A(proteinkinaseA ,PKA)活性变化的影响 .在HeLa细胞膜表面存在 2种不同解离平衡常数 (Kd)的AFP受体 ,Kd1=5 2pmol L(2 10 0位点 细胞 ) ;Kd2 =2 3nmol L (114 0 0位点 细胞 ) .在AFP(2 0mg L)作用下 ,HeLa细胞内cAMP浓度变化及PKA活性的改变为与对照组比较 ,用PTX预处理前cAMP浓度升高 2 6 7% ,PKA活性增高 10 3 2 % ;用PTX预处理后升高 86 % ,PKA活性增高 2 5 3% .抗甲胎蛋白单克隆抗体可阻断AFP对细胞cAMP浓度和PKA活性的影响 .结果证明 ,在HeLa细胞膜上有 2种不同解离平衡常数的甲胎蛋白受体存在 ,受体有可能通过cAMP PKA途径介导信号转导 .

基于DA受体cAMP-PKA信号通路探讨加味当归芍药散治疗HPRL大鼠的机制

目的研究加味当归芍药散治疗高泌乳素血症(HPRL)大鼠的机制。方法 96只雌性SD大鼠采用随机数字表分为空白组,模型组,阳性组,高、中、低浓度组,每组16只,经背部皮下注射甲氧氯普胺液,制造HPRL模型,5天后造模成功,定时定量给药30天后立即处死取材,采用免疫组化法检测下丘脑多巴胺D1受体(DRD1)、D2受体(DRD2)、蛋白激酶A(PKA)的表达,酶联反应法(Elisa)检测各组大鼠血泌乳素(PRL)、多巴胺(DA)、环磷酸腺苷(cAMP),实时荧光定量PCR检测各组HPRL模型大鼠下丘脑多巴胺D1受体mRNA (DRD1 mRNA)、多巴胺D2受体mRNA(DRD2 mRNA)。结果与模型组相比,中高浓度组PRL水平降低[(260.12±4.814)、(241.98±8.351)比(332.18±9.472)](P<0.05),cAMP水平显著性降低[(1.05±0.427)、(0.89±0.745)比(1.37±0.002)](P<0.01),DA表达数量升高[(41.53±6.19)、(50.69±3.28)比(14.87±5.12)](P<0.05),三组不同浓度中药组与模型组比较,PKA活性明显降低,且低浓度组略高于高浓度组[(0.30±0.024)、(0.23±0.061)、(0.20±0.034)比(0.51±0.037),(0.30±0.024)比(0.20±0.034)](P<0.05);DRD1 mRNA表达各浓度组无差异、DRD2 mRNA表达增高且高浓度组表达量明显高于低浓度组[(0.20±0.322)比(0.11±0.700),P<0.05];与模型组比,DRD1有增高趋势,DRD2除了低浓度组数量略增高[(0.34±0.040)比(0.41±0.019),P<0.05],其余均明显增高(P<0.01)。结论加味当归芍药散可能作用于DRD2通过cAMPP-PKA信号通路发挥治疗高泌乳素血症模型大鼠的作用。

基于VIP-cAMP-PKA-AQP8通路探讨痛泻要方对腹泻型肠易激综合征的治疗机制

目的基于VIP-cAMP-PKA-AQP8通路探讨痛泻要方对腹泻型肠易激综合征(IBS-D)的治疗机制。方法选取2020年7月~2021年8月在我院治疗的106例肠易激综合征(IBS)患者为研究对象,根据罗马Ⅲ诊断标准和IBS亚型分型标准将其分为腹泻型(IBS-D组,n=74)和便秘型(IBS-C组,n=32),同期选取30例健康志愿者作为健康对照组。采用RT-PCR检测三组研究对象AQP8 mRNA、VIP mRNA表达,分析AQP8、VIP基因表达的相关性。IBS-D组患者给予痛泻要方治疗,比较治疗前后AQP8 mRNA、VIP mRNA、蛋白激酶A(PKA)及环磷酸腺苷(cAMP)表达水平,并分析各指标与疗效的相关性。结果IBS-D组AQP8 mRNA表达水平低于IBS-C组和健康对照组,VIP mRNA表达水平高于IBS-C组和健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。AQP8 mRNA与VIP mRNA表达量呈负相关(r=-0.534,P=0.000)。治疗后,IBS-D组患者AQP8 mRNA表达水平高于治疗前,VIP mRNA、PKA、cAMP表达水平低于治疗前,差异有统计学意义(P<0.05)。AQP8 mRNA表达水平与疗效呈正相关(r=0.671,P<0.05),而VIP mRNA、PKA、cAMP表达水平与疗效呈负相关(r=-0.423、-0.545、-0.397,P<0.05)。结论IBS患者症状与AQP8 mRNA、VIP mRNA表达密切相关,痛泻要方可能是基于VIP-cAMP-PKA-AQP8通路发挥其药理作用。

对cAMP-PKA信号通路参与慢性心理应激大鼠心律失常机制的研究

目的:研究cAMP-PKA信号通路参与慢性心理应激大鼠心律失常的机制。方法:将60只SD大鼠随机分为空白组、模型对照组和干预组,每组各有20只大鼠。采用Cronli法对模型对照组大鼠和干预组大鼠进行干预,建立慢性抑郁大鼠模型,并用氟西汀为干预组大鼠灌胃。建模及干预后,观察并比较三组大鼠心律失常的发生率及其心肌中环磷酸腺苷(cAMP)的水平及蛋白激酶A(PKA)的密度值。结果:建模及干预后,模型对照组大鼠与干预组大鼠室性早搏的发生率、房性早搏的发生率和房室交接性早搏的发生率均高于空白组大鼠,P<0.05;干预组大鼠室性早搏的发生率低于模型对照组大鼠,P<0.05;模型对照组大鼠与干预组大鼠房性早搏的发生率及房室交接性早搏的发生率相比,P>0.05。建模及干预后,模型对照组大鼠心肌中cAMP的水平及PKA的密度值均低于空白组大鼠与干预组大鼠,P<0.05;空白组大鼠与干预组大鼠心肌中cAMP的水平及PKA的密度值相比,P>0.05。结论:心理应激大鼠发生心律失常与其cAMP-PKA信号通路下调有关,氟西汀可通过上调心理应激大鼠心肌中cAMP和PKA的表达而起到缓解其心律失常的作用。

钙调素高表达对NRK细胞中DG-PKC和cAMP-PKA水平的影响

钙调素（ＣａＭ）作为Ｃａ２＋的主要受体，对细胞增殖起重要调节作用，而且在转化细胞中ＣａＭ的水平明显高于正常细胞．ｃＡＭＰ作为一种第二信使，起着将细胞外刺激信号转化为细胞内各种生理活动的媒介作用．蛋白激酶Ａ（ＰＫＡ）则是这种转化过程中的关键激酶．蛋白激...

PGE2通过EP2受体激活cAMP-PKA-CREB信号通路上调SnoN的表达而促进CCLP1细胞的增殖

目的:探讨前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)对人胆管上皮癌细胞CCLP1增殖能力影响的作用机制。方法:用PGE2、EP1～4 4种受体激动剂、AC激动剂Forskolin、PKA抑制剂H89、cAMP拟似物db-cAMP处理CCLP1细胞,通过RT-PCR、Western blot、WST等实验检测SnoN mRNA、SnoN蛋白等表达水平、CREB蛋白磷酸化水平以及CCLP1细胞增殖能力的变化。结果:10μmol/L PGE2处理CCLP1细胞24 h后,SnoN mRNA的表达水平与对照组相比上升了22.5%(P<0.01),SnoN蛋白的表达水平上升了35.6%(P<0.05);10μmol/L EP受体激动剂处理CCLP1细胞24 h后,SnoN蛋白的表达水平与对照组相比明显增高,其中以EP2受体激动剂的作用最明显,上升了64.9%(P<0.05),细胞增殖能力上升了26.5%;10μmol/L AC激动剂Forskolin处理CCLP1细胞24 h后,SnoN蛋白的表达水平及CREB蛋白的磷酸化水平较对照组分别上升了25.1%、71.3%(P<0.05),细胞增殖能力也上升了4.4%(P<0.05);用500μmol/L cAMP拟似物dbcAMP处理CCLP1细胞24 h后,SnoN蛋白的表达水平较对照组上升了90.1%(P<0.05);而PKA抑制剂H89阻断Forskolin的作用后,SnoN蛋白的表达水平和CREB蛋白的磷酸化水平较Forskolin处理组分别下降了9.1%、14.1%,20μmol/L H89处理CCLP1细胞后,细胞增殖能力较对照组下降了45.7%(P<0.05)。结论:PGE2可通过EP2受体激活cAMP-PKA-CREB信号转导通路上调CCLP1细胞SnoN的表达,从而促进CCLP1细胞的增殖。

基于大肠主津理论助阳通便膏对便秘模型小鼠结肠组织VIP-CAMP-PKA-AQP3通路的影响

目的观察助阳通便膏对便秘模型小鼠结肠组织VIP-CAMP-PKA-AQP3信号通路的影响。方法将作为实验对象的96只雄性BALB/C小鼠随机分成4组,即正常对照组、模型对照组、助阳通便膏组以及麻仁软胶囊组,24只/组。造模予以复方地芬诺酯片混悬液灌胃的方法进行。在模型建立后,每组小鼠对应给予蒸馏水、助阳通便膏及麻仁软胶囊连续行2周灌胃,结束后取材,应用不同方法——RT-PCR法、Wester Blot法及免疫荧光双标法,观测各组小鼠的结肠组织中血管活性肠肽(VIP)、环磷酸腺苷(CAMP)、蛋白激酶(PKA)和水通道蛋白3(AQP3)的表达。结果通过RT-PCR的方法发现,助阳通便膏组VIP、AQP3mRNA表达水平显著高于模型对照组(P<0.05)。通过Wester Blot的方法发现,助阳通便膏组VIP、CAMP、PKA、AQP3蛋白相对表达水平灰度值均显著高于模型对照组(P<0.05),且助阳通便膏组AQP3、CAMP蛋白相对表达水平灰度值较麻仁软胶囊组显著增高(P<0.05),与正常对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。通过免疫荧光双标的方法发现,助阳通便膏组VIP-AQP3、CAMP-PKA免疫荧光双标表达双阳性细胞数均显著高于模型对照组(P<0.05)。且助阳通便膏组VIP-AQP3双阳性细胞数与正常对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论助阳通便膏治疗慢传输型便秘的作用机制可能是通过提高结肠组织中VIP-CAMP-PKA-AQP3通路表达水平来实现的。

TRPM8通过cAMP-PKA/UCP4信号调控氧糖剥夺/复糖复氧诱导的神经元凋亡

目的探究TRPM8在氧糖剥夺/复糖复氧诱导神经元PC12细胞凋亡中的分子机制。方法体外建立氧糖剥夺/复糖复氧模型模拟脊髓缺血再灌注损伤,流式细胞仪检测PC12细胞的凋亡,RT-PCR和western blot检测TRPM8、UCP4和c AMP、p-PKA、Bax、Bcl-2的表达变化;向PC12细胞分别加入AMTB(TRPM8阻断剂)和转染UCP4质粒,western blot检测c AMP、p-PKA、UCP4、Bax、Bcl-2的表达水平;抑制PKA信号,检测UCP4、Bax、Bcl-2的蛋白表达水平。结果氧糖剥夺/复糖复氧导致脊髓神经元PC12细胞发生凋亡,TRPM8过表达,UCP4表达下降,抑制c AMP-PKA信号。抑制TRPM8表达,则细胞凋亡减少,c AMPPKA信号被激活,且UCP4的表达有所恢复。抑制TRPM8和c AMP-PKA信号,UCP4的表达减少,细胞凋亡增加。结论在氧糖剥夺/复糖复氧模型中,PC12细胞TRPM8过表达,且通过c AMP-PKA/UCP4诱导神经元PC12细胞凋亡。

cAMP-PKA信号通路在多囊肾病间质病变中作用的研究

目的本课题拟采用MDCK细胞模型、胚胎肾模型和Pkd1基因敲除小鼠模型系统研究cAMP-PKA信号通路在ADPKD肾间质病变中的作用;同时以TGF-β1（transforming growthfactor-β1,TGF-β1）活化的信号通路为靶标,观察cAMP-PKA信号通路对其调节作用.方法在体模型采用Pkd1flox/＋;Ksp-Cre小鼠,分别收集出生后1,3,5,7天小鼠肾脏,分为WT（Wild-type,WT）和Pkd1肾组织特异性敲除的纯合子两组,用Westernblot方法检测其肾脏内TGF-β1、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）和纤连蛋白（fibronectin,FN）的蛋白表达水平变化.取13-5天小鼠胚胎肾,进行离体组织培养,实验组于第0天开始给予8-Br-cAMP刺激,显微镜拍摄各组肾组织形态学图片,并于第6天提取肾组织蛋白,Westernblot方法检测纤维化相关蛋白表达水平变化.体外模型采用MDCK（Madin-Darby canine kidney）细胞,给以不同条件刺激,提取蛋白.结果Pkd1敲除小鼠肾组织中TGF-β1,CTGF,FN的蛋白表达水平明显高于WT小鼠.8Br-cAMP可促进胚胎肾组织中FN,typeIcollagen蛋白表达水平升高.Forskolin（10μmol·L^-1）孵育MDCK细胞可以引起纤维化相关蛋白TGF-β1、CTGF、FN和typeIcollagen的表达水平升高,且该作用可被PKA抑制剂H89所抑制.给予Forskolin可抑制由TGF-β1引起的p-ERK、FN蛋白表达水平的升高;ERK抑制剂可抑制由TGF-β1引起的CTGF、FN、typeIcollagen的表达水平升高.另外,TGF-β1（10μg·L-1）可以诱导MD-CK细胞发生EMT过程,但是forskolin不能阻止EMT的发生.结论实验结果证明cAMP-PKA信号通路参与了ADPKD间质纤维化过程,并且具有双向调节作用.在MDCK细胞中cAMP-PKA信号通路一方面可以直接促进TGF-β1及其下游的间质纤维化相关蛋白分子的表达水平升高,促进ADPKD间质纤维化进程;另一方面又可以抑制TGFβ1活化的ERK信号通路和FN的蛋白表达水平升高.