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猪圆环病毒3型Cap蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA检测方法的建立 被引量:1
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作者 张宝戈 黄雅琴 +2 位作者 蔡金双 朱晨光 李玉峰 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期1170-1178,共9页
旨在建立检测猪圆环病毒3型(PCV3)抗体的阻断ELISA方法,本研究利用原核表达的PCV3Cap重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备获得了一株分泌阻断效果良好抗体的杂交瘤细胞株2E6。以重组Cap蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的2E6单克隆... 旨在建立检测猪圆环病毒3型(PCV3)抗体的阻断ELISA方法,本研究利用原核表达的PCV3Cap重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备获得了一株分泌阻断效果良好抗体的杂交瘤细胞株2E6。以重组Cap蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的2E6单克隆抗体作为检测抗体,经条件优化后建立了一种检测PCV3抗体的阻断ELISA方法。用建立的阻断ELISA方法检测50份临床阴性血清,计算阻断率(PI)的临界值,以此来确定该方法的判定标准:当PI≤28.30%时,判定结果为阴性;当PI≥35.05%时,判定结果为阳性;当28.30%<PI<35.05%时,判定为可疑,重复一次试验后如果结果仍为可疑,则判定为阳性。特异性试验表明该方法与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)以及猪瘟病毒(CSFV)的阳性血清均无交叉反应;敏感性试验表明其检测效价可达到1:128;重复性试验表明批内与批间的变异系数均小于10%;符合性检验表明该方法与PCV检测金标准免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)比对的Kappa值达0.9,具有高度的一致性。综上所述,本研究建立的阻断ELISA方法具有良好的特异性与较高的符合率,可用于后期进行PCV3抗体的检测,为PCV3的流行病学调查与临床诊断提供技术支持。 展开更多
关键词 猪圆环病毒3型 cap重组蛋白 单克隆抗体 阻断ELISA
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猪圆环病毒2型Cap蛋白的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的初步建立
2
作者 严杰聪 王帅勇 +11 位作者 王曼茱 王娟 荣新利 邢燕茹 虞凌雪 周艳君 单同领 童武 郑浩 刘长龙 童光志 于海 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第4期79-84,共6页
Cap蛋白作为猪圆环病毒2型(PCV2)的主要结构蛋白,构成病毒的核衣壳,是PCV2的主要免疫保护性抗原,在PCV2血清学诊断中具有重要意义。本研究根据PCV2的ORF2基因序列设计特异性引物,通过PCR方法扩增得到去核定位信号肽的ORF2基因,并通过同... Cap蛋白作为猪圆环病毒2型(PCV2)的主要结构蛋白,构成病毒的核衣壳,是PCV2的主要免疫保护性抗原,在PCV2血清学诊断中具有重要意义。本研究根据PCV2的ORF2基因序列设计特异性引物,通过PCR方法扩增得到去核定位信号肽的ORF2基因,并通过同源重组将其克隆至原核表达载体pCold-Ⅰ中,经测序鉴定成功获得重组质粒pCold-Ⅰ-Cap。将重组质粒转化至感受态细胞BL21中进行表达,通过考马斯亮蓝染色以及免疫印迹试验检测Cap蛋白的表达,同时将纯化后的重组蛋白通过优化反应条件建立检测PCV2血清抗体的间接ELISA方法。结果表明:重组去核定位信号肽Cap蛋白可溶性表达且可以与PCV2阳性血清特异性结合,通过探索不同蛋白包被浓度以及不同一抗孵育浓度初步建立了间接ELISA检测方法,进而为PCV2抗体的有效监测奠定基础。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 cap蛋白 同源重组 表达纯化 ELISA
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昆虫杆状病毒表达的猪圆环病毒2d型Cap蛋白-VLP对仔猪的免疫保护效果
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作者 王亚文 张亚楠 +4 位作者 袁晨 任静 苏恺 杨柳 宋勤叶 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期76-84,共9页
猪圆环病毒2d基因型(Porcine circovirus type 2d,PCV2d)为猪场当前流行的PCV2优势基因型,为了研究针对PCV2d基因型的病毒样颗粒(Virus-like particle,VLP)疫苗,提高猪圆环病毒病的防控效果。本研究利用杆状病毒表达系统表达了能够自组... 猪圆环病毒2d基因型(Porcine circovirus type 2d,PCV2d)为猪场当前流行的PCV2优势基因型,为了研究针对PCV2d基因型的病毒样颗粒(Virus-like particle,VLP)疫苗,提高猪圆环病毒病的防控效果。本研究利用杆状病毒表达系统表达了能够自组装为VLP的PCV2d-Cap蛋白,然后将9头21日龄健康仔猪随机分为VLP组、攻毒对照组和空白对照组(n=3)。VLP组的每头仔猪经颈部肌肉注射400μg Cap蛋白-佐剂复合物(PCV2d-VLP),攻毒组注射等体积的PBS与佐剂混合物,空白组注射等体积的PBS。共接种2次,每次间隔14 d。于第2次免疫后21 d,VLP组和攻毒对照组的仔猪通过鼻腔感染PCV2 HBDX-2018株(106TCID50/头),评价PCV2d-VLP诱导的免疫效果。结果表明PCV2d-VLP能够诱导仔猪产生高水平的特异性IgG抗体和中和抗体,刺激IFN-γ水平升高,引起外周血淋巴细胞增殖能力增强,降低病毒经鼻腔和直肠的排毒率及病毒血症阳性率,减轻腹股沟淋巴结和脾脏的病理损伤,降低组织中的病毒载量。上述研究表明,应用杆状病毒表达的PCV2d-Cap蛋白能自组装为VLP,并能诱导仔猪产生良好的免疫保护效应,具有进一步开发为PCV2d-VLP疫苗的潜力。 展开更多
关键词 PCV2d cap蛋白 病毒样颗粒 杆状病毒 免疫效果
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猪圆环病毒3型Cap重组蛋白的低温诱导表达研究
4
作者 潘向英 祝羊 +8 位作者 曾智勇 汤德元 梁海英 王彬 叶泥 田红利 边孟婷 柳佳佳 黄书 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2024年第15期73-77,共5页
为了提高猪圆环病毒3型(PCV-3)Cap重组蛋白的可溶性表达量,试验采用PCR方法扩增PCV-3 Cap基因,将其插入原核表达载体pET-32a(+)中构建重组原核表达载体pET-32a(+)-Cap,再将重组原核表达载体转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中,分... 为了提高猪圆环病毒3型(PCV-3)Cap重组蛋白的可溶性表达量,试验采用PCR方法扩增PCV-3 Cap基因,将其插入原核表达载体pET-32a(+)中构建重组原核表达载体pET-32a(+)-Cap,再将重组原核表达载体转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中,分析不同浓度IPTG和温度的诱导表达效果,并通过Western-blot鉴定重组蛋白。结果表明:PCR扩增出大小为645 bp的Cap基因片段,与预期结果一致;构建的重组原核表达载体pET32a(+)-Cap可在大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中表达,重组蛋白分子量约为43.1 ku;不同浓度IPTG诱导表达可溶性蛋白的表达量不同,IPTG终浓度为0.1 mmol/L时重组蛋白可溶性表达量较高;37℃诱导时重组蛋白主要在沉淀中表达,而20℃诱导时重组蛋白主要在上清液中表达;表达的重组蛋白能与带His标签的抗体特异性结合。说明试验成功构建了重组蛋白,低温诱导可获得了更多的可溶性蛋白。 展开更多
关键词 猪圆环病毒3型 cap蛋白 低温诱导 原核表达 可溶性蛋白
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Protein-losing pseudomembranous colitis with cap polyposis-like features 被引量:2
5
作者 Wolfgang Kreisel Guenther Ruf +6 位作者 Richard Salm Adhara Lazaro Bertram Bengsch Anna-Maria Globig Paul Fisch Silke Lassmann Annette Schmitt-Graeff 《World Journal of Gastroenterology》 SCIE CAS 2017年第16期3003-3010,共8页
Protein-losing enteropathy(PLE) is characterized by loss of serum proteins into the gastrointestinal tract. It may lead to hypoproteinemia and clinically present as protein deficiency edema, ascites, pleural or perica... Protein-losing enteropathy(PLE) is characterized by loss of serum proteins into the gastrointestinal tract. It may lead to hypoproteinemia and clinically present as protein deficiency edema, ascites, pleural or pericardial effusion and/or malnutrition. In most cases the site of protein loss is the small intestine. Here we present an unusual case of severe PLE in a 55-year old female with a one-year history of recurrent diarrhea, crampy abdominal pain, and peripheral edema. Endoscopy and MRI showed a diffuse inflammatory thickening of the sigmoid colon and the rectum. Surgical resection of the involved colon was performed and the symptoms were significantly resolved. The final histologic evaluation confirmed a diagnosis of a pseudomembranous colitis with cap polyposis-like features. Such a cause of PLE has never been described before. 展开更多
关键词 protein-losing ENTEROPATHY cap POLYPOSIS ULCERATIVE COLITIS Goblet cells Pseudomembranes
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猪圆环病毒3型四川株Cap蛋白的截短表达及其抗体间接ELISA方法的建立
6
作者 欧云文 潘琴 +5 位作者 汪洋 代军飞 任绍科 张洋 翟佳佳 张杰 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期3056-3066,共11页
【目的】原核截短表达猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV3)四川株Cap蛋白(1-197位氨基酸),并建立其抗体间接ELISA检测方法,为PCV3血清学调查提供材料。【方法】以PCV3四川分离株基因组为模板,PCR扩增获得Cap蛋白编码基因片段... 【目的】原核截短表达猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV3)四川株Cap蛋白(1-197位氨基酸),并建立其抗体间接ELISA检测方法,为PCV3血清学调查提供材料。【方法】以PCV3四川分离株基因组为模板,PCR扩增获得Cap蛋白编码基因片段,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中构建重组质粒pET30a-PCV3-Cap。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,Ni-NTA树脂亲和层析纯化,获得具有良好抗原性的重组Cap蛋白。基于纯化的重组Cap蛋白建立间接ELISA方法,确定最佳抗原包被浓度、待检血清最佳稀释比例、酶标抗体稀释比例和阴阳性临界值,对间接ELISA方法的特异性、敏感性、重复性、相关性和符合率进行分析,并对2018-2022年采自川东北地区猪场的351份临床猪血清进行检测,分析该区域PCV3流行情况。【结果】试验成功构建pET30a-PCV3-Cap重组表达载体,实现重组Cap蛋白(1-197位氨基酸)的原核截短表达,蛋白大小约为26 ku,可与PCV3阳性猪血清发生特异性反应;确定最佳抗原包被浓度为1 ng/μL,待检血清最佳稀释比例为1∶100,酶标抗体稀释比例为1∶60000,阴阳性临界值D_(450 nm)为0.684;建立的间接ELISA方法与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)和猪细小病毒1型(PPV1)阳性猪血清均不发生交叉反应,敏感度达1∶1600,批内变异系数和批间变异系数均<10%,与病毒中和试验(VNT)结果呈正相关,与Western blotting方法的阳性符合率为95.8%;2018-2022年川东北地区的351份猪血清样品阳性率为7.12%。【结论】本研究成功截短表达了PCV3四川株Cap蛋白(1-197位氨基酸),建立了特异性强、灵敏度高、重复性好和符合率高的PCV3间接ELISA方法,为PCV3的血清学调查和检测试剂盒的开发提供了材料。 展开更多
关键词 猪圆环病毒3型(PCV3) cap蛋白 截短表达 ELISA
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猪圆环病毒2型Cap蛋白的原核表达及其单克隆抗体制备
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作者 孙荣航 容芳 +2 位作者 陈桂娥 刘郁夫 陈瑞爱 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2024年第14期61-67,73,126,共9页
为了制备猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)Cap蛋白单克隆抗体,试验将Cap基因克隆至原核表达载体pET-28a(+)上并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,将获得的重组表达菌pET28a-Cap/BL21(DE3)用IPTG进行诱导后表达重组蛋... 为了制备猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)Cap蛋白单克隆抗体,试验将Cap基因克隆至原核表达载体pET-28a(+)上并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,将获得的重组表达菌pET28a-Cap/BL21(DE3)用IPTG进行诱导后表达重组蛋白,利用His标签对表达的重组蛋白进行纯化;将纯化后的重组蛋白于皮下免疫Balb/c小鼠,免疫结束后测定免疫小鼠血清效价,当小鼠血清抗体效价达到1∶100000时进行细胞融合;采用有限稀释法进行亚克隆,筛选能够稳定分泌抗体且抗体效价高的阳性杂交瘤细胞株,鉴定杂交瘤细胞株抗体亚类,并选择1株抗体效价最高的细胞株再次注射到小鼠腹腔中(5×10^(5)个/只),取腹水采用亲和层析法对单克隆抗体进行纯化;采用间接ELISA方法测定单克隆抗体效价并检测其特异性,分别采用Western-blot和间接免疫荧光试验检测单克隆抗体的反应性。结果表明:PCR扩增得到大小为708 bp的Cap基因,经双酶切与测序验证后,成功构建重组表达质粒pET28a-Cap;重组表达菌pET28a-Cap/BL21(DE3)经诱导后表达的重组蛋白可与His标签抗体发生特异性反应,纯化后的重组蛋白在预期位置(31.7 ku)出现清晰的单一条带;共筛选出8株能够稳定分泌抗体且抗体效价高的阳性单克隆细胞株(1E5、2A9、3C6、4B3、5F7、6D11、7A2、8G1株),抗体亚类鉴定均为IgG1亚类。其中7A2株抗体效价最高,用于单克隆抗体的制备;间接ELISA方法证实7A2株单克隆抗体仅与PCV-2 Cap蛋白发生反应,与猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)和猪伪狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)不发生反应;Western-blot和间接免疫荧光试验均证实PCV-2 Cap蛋白可被7A2株单克隆抗体特异性识别。说明本试验成功制备出具有高纯度、强特异性、良好反应性的PCV-2 Cap蛋白单克隆抗体。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型(PCV-2) 单克隆抗体 cap蛋白 细胞融合 亚克隆
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Homology Modelling and Structural Comparisons of Capsid-Associated Proteins from Circoviruses Reveal Important Virus-Specific Surface Antigens 被引量:1
8
作者 Edward I. Patterson Jade K. Forwood Shane R. Raidal 《Crystal Structure Theory and Applications》 2012年第2期9-16,共8页
Circoviridae represent a growing family of small animal viruses. Some of these viruses have veterinary and medical importance, although, a vast amount of these newly discovered viruses have unknown effects on their ho... Circoviridae represent a growing family of small animal viruses. Some of these viruses have veterinary and medical importance, although, a vast amount of these newly discovered viruses have unknown effects on their hosts. The capsid-associated protein (Cap) of circoviruses is of interest because of its role in viral structure, immune evasion, host cell entry, and nuclear shuttling of viral components. The structure of the porcine circovirus 2 (PCV2) Cap has been solved and offered insight to these functions. Based on the crystallographic PCV2 Cap structure, models from circoviruses isolated from avian, fish, and mammalian hosts have been constructed and analyzed to better understand the roles of these proteins in the virus family. A high degree of conservation is observed in the models, however, the surface antigens differ among viruses. This is likely a reflection of the small genome harbored by circoviruses, and therefore the requirement of their few proteins to carry out specific vital functions, while maintaining enough variation to successfully infect their hosts. Here we describe the putative structures of a range of Cap proteins from circoviruses based on the crystallographic determination of porcine Cap, identifying key regions for function and inhibition of crystal formation. 展开更多
关键词 CIRCOVIRUS capsid-Associated protein Structure HOMOLOGY cap Modelling
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The Mapping and Characterization of Cruella (Cru), a Novel Allele of Capping Protein α (Cpa), Identified from a Conditional Screen for Negative Regulators of Cell Growth and Cell Division
9
作者 Ashley Cosenza Jacob D. Kagey 《Advances in Bioscience and Biotechnology》 2016年第10期373-380,共8页
A Flp/FRT EMS mutagenesis screen was conducted in the eye of Drosophila melanogaster on chromosome 2R to identify negative regulators of cell growth and cell division. In addition to the EMS mutation in the mosaic eye... A Flp/FRT EMS mutagenesis screen was conducted in the eye of Drosophila melanogaster on chromosome 2R to identify negative regulators of cell growth and cell division. In addition to the EMS mutation in the mosaic eye, an ark loss of function allele (ark<sup>82</sup>) was utilized to block apoptosis in the homozygous mutant cells, setting up a screen for conditional regulators of cell growth and cell division. In the present study, we focus on the characterization and mapping of one mutant that resulted from this screen, Cruella (cru). A cross between flies with the flippase enzyme directed to the developing eye and flies with the mutations cru, ark<sup>82</sup>, revealed an unusual phenotype that resulted in the homozygous mutant tissue appearing black, in contrast to the expected red. To map the location of this mutation, complementation tests against the Bloomington deficiency kit were conducted. Cru failed to complement previously characterized alleles of capping protein α (cpa). Thus, cpa<sup>cru</sup> is a novel allele of cpa and displays phenotypes similar to previously characterized alleles such as cpa 107E, cpa 69E, and cpa<sup>scrd</sup> . The human homolog, Cap Z, is conserved in humans and serves a similar role in act in filament regulation. 展开更多
关键词 capping protein α APOPTOSIS Genetic Screen Drosophila melanogaster
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猪圆环病毒3型Cap蛋白的原核表达与鉴定
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作者 朱钰英 高翠翠 +6 位作者 唐青海 刘婷 赵婷芳 曾沛暄 赵铖 胡意 李小申 《湖南畜牧兽医》 2024年第2期35-38,共4页
[目的]研究旨在扩增PCV3病毒的Cap基因,体外表达PCV3 Cap蛋白。[方法]试验分别建立重组原核表达载体p ET28a-PCV3-Cap和p Cold-PCV3-Cap,转化Rosetta(DE3)表达菌株,在不同温度条件下诱导表达蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting进行蛋... [目的]研究旨在扩增PCV3病毒的Cap基因,体外表达PCV3 Cap蛋白。[方法]试验分别建立重组原核表达载体p ET28a-PCV3-Cap和p Cold-PCV3-Cap,转化Rosetta(DE3)表达菌株,在不同温度条件下诱导表达蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting进行蛋白鉴定。[结果]PCV3 Cap蛋白在p ET28a原核表达系统中无表达;Rosetta-p Cold-PCV3-Cap在诱导温度为15℃、IPTG浓度为1.0 mmo L/L、诱导4 h的条件下,能够表达分子量约为25 k Da的Cap蛋白,且为可溶性表达。[结论]试验成功制备了PCV3 Cap蛋白,为制备PCV3疫苗及其诊断方法的研究提供了基础材料。 展开更多
关键词 猪圆环病毒3型(PCV3) cap蛋白 原核表达 鉴定
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杆状病毒表达系统中NLS序列对鸭圆环病毒Cap基因表达的影响及其免疫原性研究
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作者 栾明朱 马跃宇 +4 位作者 刘立 孙莉 李明 费东亮 马鸣潇 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2024年第3期66-72,共7页
为了研究核定位信号肽(Nuclear localization signal,NLS)序列对鸭圆环病毒(duck Circovirus,DuCV)Cap蛋白表达的影响,并探究不同免疫策略下重组蛋白的免疫原性,试验将去除和未去除NLS序列的DuCV Cap基因分别克隆至杆状病毒载体pFastBa... 为了研究核定位信号肽(Nuclear localization signal,NLS)序列对鸭圆环病毒(duck Circovirus,DuCV)Cap蛋白表达的影响,并探究不同免疫策略下重组蛋白的免疫原性,试验将去除和未去除NLS序列的DuCV Cap基因分别克隆至杆状病毒载体pFastBacⅠ中,通过杆状病毒表达系统进行表达,分析NLS序列对Cap蛋白表达的影响。采用不同的免疫策略,分别以原核表达系统构建的重组蛋白rCap(rCap组)、杆状病毒表达系统构建的rvAc-Cap(rvAc-Cap组)及rCap与rvAc-Cap联合(Prime-Boost组)作为免疫源免疫Balb/c小鼠,并设置PBS对照组,定期采血,检测DuCV IgG抗体水平、淋巴细胞增殖指数(SI)和γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)等细胞因子水平,评价其免疫效果。结果表明:利用杆状病毒表达系统成功表达出重组杆状病毒rvAc-Cap和rvAc-NLS-Cap,且去除NLS序列的Cap基因表达水平更高;小鼠免疫重组蛋白rCap后,重组蛋白rCap与重组杆状病毒rvAc-Cap均能够刺激小鼠产生特异性IgG抗体,三免后Prime-Boost组的IgG抗体水平最高,而与其他免疫组差异不显著(P>0.05);三免后各免疫组淋巴细胞增殖指数显著高于PBS对照组,差异显著(P<0.05);各免疫组IFN-γ、IL-2和IL-4水平与PBS对照组比较差异显著(P<0.05),且Prime-Boost组水平最高。说明在杆状病毒表达系统中去除NLS序列可以提高Cap基因的表达;重组杆状病毒rvAc-Cap能够活化小鼠的免疫系统,刺激小鼠机体产生体液免疫与细胞免疫,而Prime-Boost免疫策略有效提高了免疫效果。 展开更多
关键词 鸭圆环病毒 cap蛋白 核定位信号肽 杆状病毒表达系统 免疫原性
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鸽圆环病毒浙江株△Cap基因的克隆与原核表达 被引量:18
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作者 余旭平 刘晓宁 +3 位作者 郑新添 邬栋栋 刘江梅 竺春 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第9期680-684,共5页
根据已发表的鸽圆环病毒(PiCV)序列,在V1ORF保守序列部位设计引物(目的片段长度为629bp),对浙江某鸽养殖场的病料进行PCR扩增检测,获得阳性样品;应用设计的删除核定位信号外壳蛋白基因(△Cap)的引物,扩增获得680bp的△Cap基因,克隆于pMD... 根据已发表的鸽圆环病毒(PiCV)序列,在V1ORF保守序列部位设计引物(目的片段长度为629bp),对浙江某鸽养殖场的病料进行PCR扩增检测,获得阳性样品;应用设计的删除核定位信号外壳蛋白基因(△Cap)的引物,扩增获得680bp的△Cap基因,克隆于pMD18-T载体,进行测序;将△Cap基因亚克隆到原核表达载体pET-28a进行融合表达,SDS-PAGE电泳检测发现,△Cap融合蛋白经IPTG诱导后在大肠杆菌中以包涵体形式表达,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的22.1%。 展开更多
关键词 圆环病毒 核定位信号 cap蛋白 表达
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抗猪圆环病毒2型Cap蛋白中和性单克隆抗体的制备及鉴定 被引量:18
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作者 黄立平 刘长明 +3 位作者 危艳武 张朝霞 陆月华 郭龙军 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期132-136,共5页
以纯化的杆状病毒表达的重组猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白(PCV2-rCap)免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞瘤杂交技术获得了5株稳定分泌抗PCV2-rCap蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为1D2、2E8、3A10、5F2和6F10。这5株杂交瘤细胞诱导同品系小鼠产... 以纯化的杆状病毒表达的重组猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白(PCV2-rCap)免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞瘤杂交技术获得了5株稳定分泌抗PCV2-rCap蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为1D2、2E8、3A10、5F2和6F10。这5株杂交瘤细胞诱导同品系小鼠产生的腹水抗体效价分别为1∶2048000、1∶512000、1∶1024000、1∶512000、1∶1024000;其中1D2、2E8、5F2和6F10单抗亚类为IgG2a,仅3A10为IgG1;2E8、3A10、5F2和6F10单抗轻链为λ型,仅1D2轻链为κ型。Western blot结果显示,这5株单抗中2E8、3A10、5F2和6F10可与自然PCV2-Cap发生反应,而1D2无反应。IPMA和抗原捕获ELISA结果表明,1D2单抗可与PCV2病毒蛋白发生反应,而与PCV1无交叉反应;病毒中和试验证实,1D2单抗具有中和活性,是一株针对PCV2-Cap蛋白中和表位的单抗。这些单抗的制备为PCV2抗原表位分析及分子诊断提供了技术手段。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 重组cap蛋白 中和活性 单克隆抗体
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猪圆环病毒2型Rep/Rep'和Cap蛋白亚单位疫苗免疫保护性试验 被引量:6
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作者 刘丹 王一平 +5 位作者 吴洪丽 危艳武 刘建波 李胜斌 魏萍 刘长明 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第11期916-919,共4页
猪圆环病毒2型(PCV2)ORF1基因编码的Rep/Rep'蛋白与病毒复制酶相关,ORF2编码的Cap蛋白为病毒核衣壳,是病毒保护性抗原。为比较这3种蛋白作为亚单位疫苗的免疫保护性,本研究以重组杆状病毒表达的PCV2-rRep、-rRep'和-rCap蛋白制... 猪圆环病毒2型(PCV2)ORF1基因编码的Rep/Rep'蛋白与病毒复制酶相关,ORF2编码的Cap蛋白为病毒核衣壳,是病毒保护性抗原。为比较这3种蛋白作为亚单位疫苗的免疫保护性,本研究以重组杆状病毒表达的PCV2-rRep、-rRep'和-rCap蛋白制备亚单位疫苗及PCV2灭活苗,分组免疫BALB/c鼠进行攻毒,以评价疫苗的免疫保护力。对PCV2-rRep和-rRep'亚单位疫苗免疫鼠血清ELISA抗体检测表明,于免疫后第14 d抗体全部转阳,第35 d抗体效价分别达到1∶42 667和1∶51 200。PCV2-rCap亚单位疫苗和PCV2灭活苗免疫组于第21 d抗体转阳,第35 d抗体效价分别达1∶2 133和1∶333。攻毒试验表明,PCV2-rCap亚单位疫苗和PCV2灭活苗免疫鼠获得完全保护;而PCV2-rRep和-rRep'蛋白亚单位疫苗免疫组无保护作用。血清中和试验表明,PCV2-rCap蛋白亚单位疫苗和PCV2灭活苗免疫鼠血清中和抗体效价达1∶1 600和1∶800;而PCV2-rRep和-rRep'蛋白亚单位疫苗免疫鼠血清无中和病毒能力。该研究表明,PCV2-Cap蛋白亚单位疫苗具有良好的免疫保护力,可以与PCV2自然感染猪产生的抗Rep蛋白抗体相鉴别,具有良好的开发前景。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 REP Rep’和cap蛋白 亚单位疫苗 免疫保护性
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猪圆环病毒2型Cap蛋白的表达及在ELISA中的初步应用 被引量:5
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作者 赵玲 朱玲 +3 位作者 郭万柱 徐志文 漆信桥 李凤勤 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期808-814,共7页
本研究旨在建立以PCV2Cap蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法,构建猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因原核表达质粒pET32a-ORF2并转化至Rosetta菌,在1.0mmol.L-1 IPTG和37℃条件下诱导下,Cap蛋白获得高效表达,Western blot检测证实其具有免疫... 本研究旨在建立以PCV2Cap蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法,构建猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因原核表达质粒pET32a-ORF2并转化至Rosetta菌,在1.0mmol.L-1 IPTG和37℃条件下诱导下,Cap蛋白获得高效表达,Western blot检测证实其具有免疫反应活性,以纯化的蛋白为抗原建立了检测猪圆环病毒2型抗体的间接ELISA方法。结果表明抗原最适包被浓度为2.16μg.mL-1;血清最佳稀释度为1∶40;抗原最佳包被条件为4℃过夜;最佳封闭条件为1%BSA 37℃1h;血清反应时间为37℃30min;酶标二抗最适作用时间为37℃45min;底物最佳反应条件为37℃显色15min。用该方法对四川省184份猪血清样品进行检测,总阳性率为80.98%(149/184),与商品化的PCV2ELISA试剂盒得到的结果基本一致。本试验成功建立了PCV2血清抗体间接ELISA方法,具有较高的敏感性和特异性,可用于大规模的血清学检测。 展开更多
关键词 圆环病毒2型 cap蛋白 间接ELISA
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猪2型圆环病毒Cap蛋白在伪狂犬病病毒中的表达 被引量:4
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作者 宋云峰 肖少波 +3 位作者 曹胜波 张松林 陈焕春 金梅林 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期155-158,共4页
用EcoR酶切伪狂犬病病毒疫苗株Tk-/gE-/LacZ+基因组,与含有猪2型圆环病毒(PCV2)ORF2基因的重组转移载体pIEORF2共转染IBRS-2细胞。收集病变细胞,经空斑纯化和PCR鉴定,获得了新的重组病毒Tk-/gE-/ORF2+。用Southern blot杂交证明该重组... 用EcoR酶切伪狂犬病病毒疫苗株Tk-/gE-/LacZ+基因组,与含有猪2型圆环病毒(PCV2)ORF2基因的重组转移载体pIEORF2共转染IBRS-2细胞。收集病变细胞,经空斑纯化和PCR鉴定,获得了新的重组病毒Tk-/gE-/ORF2+。用Southern blot杂交证明该重组病毒构建正确,用间接免疫荧光法和Western blot证明该重组病毒可表达PCV2的主要免疫原性蛋白Cap蛋白。重组病毒在IBRS-2细胞上连续传15代后,遗传稳定。该重组病毒在IBRS-2细胞上增殖滴度为10-7.1TCID50/0.1mL,在鸡胚成纤维细胞上增殖滴度为10-4.8TCID50/0.1mL,在Marc-145细胞上增殖滴度为10-6.8TCID50/0.1mL。 展开更多
关键词 猪2型圆环病毒(PCV2) cap蛋白 ORF2基因 疫苗
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猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白重组腺病毒的构建与鉴定 被引量:11
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作者 王先炜 姜平 +2 位作者 李玉峰 蒋文明 汤景元 《中国病毒学》 CSCD 2006年第1期29-33,共5页
猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)是近年来新发现的引起仔猪多系统衰弱综合症的必需病原,含有两个主要的阅读框ORF1和ORF2,分别编码复制相关蛋白(Rep)和核衣壳蛋白(Cap),其中Cap含有病毒主要抗原表位,是研究PCV2基因工程苗的主要候选目的基因。本... 猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)是近年来新发现的引起仔猪多系统衰弱综合症的必需病原,含有两个主要的阅读框ORF1和ORF2,分别编码复制相关蛋白(Rep)和核衣壳蛋白(Cap),其中Cap含有病毒主要抗原表位,是研究PCV2基因工程苗的主要候选目的基因。本研究利用PCR技术将Cap蛋白基因克隆入人5型腺病毒穿梭载体(pShuttle-CMV),与腺病毒骨架载体(pAdEasyTM)共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组并转染HEK-293A细胞,经多次亚克隆获得了重组腺病毒rAd-Cap,测定其TCID50为1013.7/mL。用RT-PCR、间接ELISA、Westernblot和IPMA等方法证明了Cap蛋白在腺病毒中获得表达。该研究为发展PCV2的重组腺病毒基因工程疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 Ⅱ型猪圆环病毒 cap蛋白 重组 腺病毒 构建
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猪圆环病毒2型衣壳蛋白(Cap)在293T细胞中的亚细胞定位 被引量:4
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作者 符芳 李曦 +4 位作者 李雪松 李海忠 陈欣 王伟 魏萍 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期338-341,共4页
猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因编码病毒的核衣壳蛋白(Cap),该蛋白属于病毒保护性抗原,具有重要免疫功能。本研究以PCV2871毒株基因组为模板,用特异性上下游引物扩增获得ORF2基因,利用真核表达载体构建了表达PCV2Cap蛋白的重组质粒pCAGGS-... 猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因编码病毒的核衣壳蛋白(Cap),该蛋白属于病毒保护性抗原,具有重要免疫功能。本研究以PCV2871毒株基因组为模板,用特异性上下游引物扩增获得ORF2基因,利用真核表达载体构建了表达PCV2Cap蛋白的重组质粒pCAGGS-ORF2。采用脂质体将pCAGGS-ORF2转染至293T细胞,用抗PCV2-Cap单克隆抗体对重组质粒转染细胞进行了免疫活性分析和免疫荧光检测,表明Cap蛋白在细胞中获得表达;利用共聚焦显微镜对Cap蛋白在293T细胞中的亚细胞定位观察结果表明,转染24h后可见Cap蛋白的表达随培养时间延长显著增多,72h达到高峰,表达的Cap蛋白主要分布在细胞核中。构建的pCAGGS-ORF2真核表达重组质粒在293T细胞中的表达,为进一步PCV2基因疫苗的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 核衣壳蛋白 真核表达 亚细胞定位
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猪圆环病毒2型Cap蛋白重组腺病毒的构建及表达 被引量:4
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作者 欧阳素贞 张福良 +2 位作者 王双山 王国栋 刘书梅 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第3期165-168,共4页
根据PCV2 Cap蛋白基因的序列设计引物,从1份患PMWS仔猪组织病料中扩增出Cap蛋白基因(702 bp)。并利用基因工程技术将Cap蛋白基因克隆入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,将其与腺病毒骨架载体(pAdeasy-1)共转化大肠杆菌BJ5183,进行同源重... 根据PCV2 Cap蛋白基因的序列设计引物,从1份患PMWS仔猪组织病料中扩增出Cap蛋白基因(702 bp)。并利用基因工程技术将Cap蛋白基因克隆入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,将其与腺病毒骨架载体(pAdeasy-1)共转化大肠杆菌BJ5183,进行同源重组后转染293细胞,在293细胞内包装出重组腺病毒。通过免疫荧光、PCR和Western blot检测证明PCV2 Cap蛋白基因在293细胞内获得表达。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型(PCV2) cap蛋白 腺病毒
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猪圆环病毒2型Cap蛋白的原核表达、纯化及抗原性分析 被引量:6
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作者 杨莹莹 刘永刚 +5 位作者 郝立沙 王刚 涂亚斌 佟杰 田丽红 蔡雪辉 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第3期14-19,共6页
为了获取大量的有良好抗原性的猪圆环病毒2型(PCV-2)重组Cap蛋白,用于PCV-2抗体检测试剂盒的研制,试验对PCV-2 ORF2全长基因进行扩增,构建重组表达质粒p ET-30a-Cap,转化E.coli BL21(DE3),在SDS-PAGE分析基础上,结合Image J和Graphp... 为了获取大量的有良好抗原性的猪圆环病毒2型(PCV-2)重组Cap蛋白,用于PCV-2抗体检测试剂盒的研制,试验对PCV-2 ORF2全长基因进行扩增,构建重组表达质粒p ET-30a-Cap,转化E.coli BL21(DE3),在SDS-PAGE分析基础上,结合Image J和Graphpad prism 5.0软件的分析,对重组菌E.coli BL21(p ET-30a-Cap)表达条件进行了优化,诱导产物纯化后,经SDS-PAGE分析及Western-blot鉴定其抗原性。结果表明:重组Cap蛋白的最佳表达条件是当菌体浓度(OD600值)达到1.0~1.5时,加入终浓度为0.2 mmol/L的IPTG,37℃恒温摇床175 r/min振荡培养5 h;纯化获得高纯度的重组Cap蛋白,且该蛋白具有良好的反应原性。说明表达的重组Cap蛋白具有良好的抗原性,能为检测PCV-2抗体的间接ELISA试剂盒的研制提供诊断抗原。 展开更多
关键词 PCV-2 ORF2 cap蛋白 大肠杆菌 优化表达 ImageJ软件 抗原性
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