茶树春梢萌发早晚关联基因CsAL1的CAPS分子标记开发

茶树(Camelliasinensis)作为一种叶用型经济植物,春梢萌发时间是关系茶叶经济价值的重要生物学性状。因此,选育茶树早生品种,对提升茶叶品质和经济效益具有重要的现实意义。以铁观音为参考基因组,通过全基因组关联分析,筛选到一个与茶树春梢萌发早晚高度相关的基因CsAL1(Auxilin-like 1,TGY040711)。运用SNP calling获得CsAL1各样本的SNPs,将SNPs与其春梢萌发表型进行关联分析,获得与早生性状显著相关的SNP位点。分析各SNPs的酶切位点,选择合适位点开发茶树早生性状相关CAPS分子标记。利用标记对12份茶树材料基因组DNA进行PCR扩增和酶切检测,随后在72份茶树材料中进一步验证,以期借助CAPS分子标记技术为探究CsAL1中单碱基位点突变与茶树早生性状的联系提供参考,为茶树早生品种的选育提供理论支撑。

利用原位杂交及CAPS标记分析芸薹属A、B和C基因组间的关系

以来源于Brassica rapa基因组(AA)的重复序列(151bp)为探针,分别同二倍体白菜型油菜(AA,2n=20)、甘蓝(CC,2n=18)和异源四倍体芥菜型油菜(AABB,2n=36)的中期染色体杂交,白菜型油菜和甘蓝的所有染色体上都有杂交信号,芥菜型油菜的染色体上显示出20个明显的信号,其余染色体上信号很弱或无,可以区分出A和B基因组。对来源于油菜3个基本种与3个复合种FAE1基因进行CAPS分析表明,3个基本种表现出不同的酶切式样,用MboI和MspI酶切表现出多态性,基因组A和C非常相似,而基因组B与A、C关系较远,同时3个复合种也并不是2个基本种的简单相加,表明异源四倍体在长期进化过程中可能发生了重排和重组。

番茄抗晚疫病基因ph-3的RAPD及CAPS标记

将番茄抗晚疫病ph-3基因已有的RAPD特异片段进行克隆、测序。根据该测序结果设计SCAR引物对抗病亲本、感病亲本、抗病池、感病池、F1个体进行扩增,均获得一条592bp的特异片段。感病基因型和杂合抗病基因型存在XbaⅠ酶切位点,酶切后分别产生了261bp、193bp和95bp以及592bp、261bp、193bp和95bp的特异性片段,纯合抗病基因型无此酶切位点,酶切结果仍为592bp的产物。这些片段能成功区分抗病材料、感病材料和F1个体,很有可能是与ph-3基因连锁的CAPS标记。

家蚕基因特异性CAPs标记获得及其分子系统学应用

选取家蚕attacin和alphaamylase基因序列,设计特异性引物,在家蚕品系P50、C108和子一代(F1)中扩增。分别采用4种不同的限制性内切酶对扩增产物酶切,最后每个基因都获得了一个CAPs分子标记。依据所得的两个CAPs分子标记对12个品系的家蚕遗传多样性进行了初步研究,构建了其分子系统树。

利用CAPS标记推测花生品种(系)FAD2位点基因型的研究

以5个高油酸含量花生品种(系)和2个普通油酸含量花生品种为试材,利用CAPS标记对这些品种(系)的FAD2位点基因型进行分析。结果表明:5个高油酸含量花生品种(系)的油酸含量均在80%以上,普通油酸含量品种花育22号和花育28号油酸含量分别为51.62%和41.38%。基于CAPS标记在7个品种(系)中的扩增产物及酶切带型分析推测,AhFAD2A位点花育28号为野生型,其他6个品种(系)符合448 G>A突变类型;AhFAD2B位点花育28号和花育22号为野生型,开农H03-3、花育32号、P76和F18符合441-442insA突变类型,而06B16在该位点不符合441-442insA突变类型。

Rf-1位点CAPS标记对水稻不同胞质雄性不育育性恢复系的关系分析

水稻育性恢复基因Rf-1是目前水稻上克隆的唯一恢复基因。通过位于Rf-1位点的两个特异性CAPS(cleavable amplified polymorphic sequences)标记对滇Ⅰ型、野败型、红莲型及BT型恢复系基因型分析,发现这四种不同胞质的恢复系在Rf-1位点具有相同的带型,滇Ⅰ型的两个保持系具有不同的带型。结果表明这四种不同胞质系统的恢复系均具有Rf-1基因。该结论与从恢复系选育的系谱分析的结果相一致的。

番茄叶霉病高抗基因Cf-9的CAPS标记创建

根据番茄叶霉病高抗基因Cf-9的基因序列设计3对特异扩增引物,以近等基因系和本组的多重PCR检测材料为试材,扩增Cf-9基因1～2867 bp之间的单拷贝片段,3对引物分别扩增出560 bp,1 000 bp,1 080 bp的特异片段.分别用限制性内切酶TaqⅠ,Hind Ⅲ,HinfⅠ,EcorⅠ酶切,限制性内切酶TaqⅠ酶切特异引物SCAR1扩增的560特异片段具有酶切多态性,抗病品种酶切出450 bp,330 bp,290 bp的特异片段,感病品种酶切出450 bp,290 bp的特异片段.初步建成番茄叶霉病高抗基因Cf-9的CAPS标记,经近等基因系及其杂交种检验,结果稳定可靠,可用于番茄Cf-9抗病基因辅助选育.

结球甘蓝BoCBF1与BoCBF2基因的CAPS标记及其对耐寒性的影响

以两份具有不同耐寒性的甘蓝自交系341和21-3为试材,根据已有拟南芥CBF1基因序列及甘蓝基因组测序拼接出的Scaffold信息,获得了甘蓝BoCBF1和BoCBF2基因编码区的全长序列。经PCR产物直接测序发现BoCBF1基因在自交系341和21-3间的变异表现为4个单核苷酸多态性(SNP),而BoCBF2基因则表现为16个SNP及1个18bp碱基的插入缺失(InDel)。为简便快捷地鉴定两个自交系间BoCBF1和BoCBF2基因序列的变异,开发了BoCBF1和BoCBF2基因的CAPS标记,分别命名为BoCBF1-TaqαⅠ和BoCBF2-BstUⅠ。利用这两个CAPS标记对两个自交系、F1、F2群体的基因型与耐寒性进行相关性分析,发现这两个基因的变异与材料的耐寒性极显著相关,可用该标记进行甘蓝耐寒育种的分子标记辅助选择。

番茄黄化卷叶病毒病抗病基因Ty-1的CAPS标记建立

本研究旨在筛选获得与番茄黄化卷叶病毒抗病基因Ty-1紧密连锁的分子标记,为番茄抗病育种提供技术支撑。根据与抗病基因Ty-1紧密连锁的RFLP标记序列设计特异引物,以抗病杂合体(Ty-1/ty-1)、抗病纯合体(Ty-1/Ty-1)和感病纯合体(ty-1/ty-1)材料提取的DNA为模板,进行PCR扩增,而后经不同的核酸内切酶酶切处理,筛选获得与Ty-1基因紧密连锁的CAPS标记。结果显示从4个标记中筛选获得了2个稳定可靠的CAPS标记,即TG97和Mi23。TG97标记在抗病杂合体产生398bp、303bp和95bp3个特异片段,抗病纯合体产生303bp和95bp2个特异片段,感病纯合体产生398bp1个特异片段。Mi23标记在抗病杂合体产生402bp和354bp2个特异片段,抗病纯合体产生402bp1个特异片段,感病纯合体产生354bp1个特异片段。研究结果表明TG97和Mi23这2个CAPS标记均为共显性标记,可用于番茄抗病育种的辅助选择中。

大麦1H特异性CAPs标记和ASA标记的创制

选取大麦１Ｈ染色体的ＳＴＳ标记ＭＷＧ９１３特异性扩增小麦，把得到的片段进行克隆。用ＴａｑＩ酶切分类并测序，把得到的序列同大麦的序列进行比较。依据比较结果，选取对大麦特异的内切酶，用该酶来酶切大麦、小麦、黑麦、长穗倡麦草、中间偃麦草、簇毛麦的ＭＷＧ９１３扩增产物，获得对大麦１Ｈ染色体特异的ＣＡＰｓ标记。同时，依据酶切位点碱基的差异设计引物对扩增的产物进行第二次扩增，得到该位点的一对染色体特异性ＡＳＡ标记。

小麦中基于转录组测序SNP的dCAPS标记的高通量开发及验证

结合六倍体小麦品系P7001与P216杂交F5代群体中1对相对性状池的二代转录组测序的单核苷酸多态性(SNP)分析结果,应用最近开发的CAPS/dCAPS Designer工具进行批量的CAPS/dCAPS(衍生/限制性内切酶多态性)标记开发,最终筛选20个CAPS/dCAPS标记进行亲本间的多态性验证。结果表明,将二代转录组测序的SNP分析结果和高通量的CAPS/dCAPS标记设计软件相结合能高效地进行多态性分子标记的开发。

利用CAPS标记辅助辣椒PVY抗性基因PVr4转育的研究

利用国外报道的与PVr4基因紧密连锁的CAPS标记,对辣椒抗PVY基因PVr4的转育进行了研究和探讨。采用与报道的相同抗源材料CdM334为回交的供体亲本,与5个自交系77013、75-7-3-1、83077、83078、83-163进行回交,在BC1代进行了分子标记的选择。从5个BC1群体75-7-3-1×(CdM334×75-7-3-1)、77013×(CdM334×77013)、83077×(CdM334×83077)、83078×(CdM334×83078)、83-163×(CdM334×83-163)中,分别检测出含有抗病连锁标记的单株21株、15株、10株、11株、12株。

瓣化型胡萝卜雄性不育基因atp6的CAPS标记建立

根据atp6的基因序列设计特异扩增引物,以瓣化型胡萝卜核质互作雄性不育系H05A及其保持系H05B为试材,扩增获得了1条约500bp的特异扩增片段。用限制性内切酶BglII对该片段进行酶切,不育系产生1条保持系中没有的特异片段,其分子量约为60bp。建立了atp6基因的CAPS标记,该分子标记可用于胡萝卜雄性不育分子标记辅助育种。

番茄高可溶性固形物基因CAPS标记的创制

根据已有的RFLP标记信息,合成PCR引物、设计限制性内切酶,就可把操作复杂、成本较高的RFLP标记转化为操作简单实用,成本适宜的CAPS标记。本实验对番茄高可溶性固形物基因的4个RFLP标记进行转化,其中TG161和TG237成功地转化为CAPS标记,并建立了各自的PCR和限制性内切酶的优化体系,大大增加了该标记在标记辅助选择等实际应用中的实用性。

基于黄麻转录组序列SNP位点的CAPS标记开发与验证

黄麻CAPS分子标记的开发,可以为黄麻遗传多样性分析、种质资源鉴定和分子标记辅助选择等研究提供有效方法。本试验以黄麻179和爱店野生种为材料,采用IlluminaHiSeq4000测序技术进行转录组测序,对其SNP位点进行分析,设计了与木质素合成基因4CL、COMT及转录因子MYB相兲的SNP引物,在此基础上,应用dCAPS Finder2.0软件开发了CAPS标记,并对其有效性进行了验证。结果表明:(1)组装后的黄麻unigene序列共72,674条,序列总长度为29,705,997 bp,检测到的SNP位点总数为67,567个,平均每440 bp有1个SNP。(2)获得了39对分别与4CL、COMT和MYB相兲的SNP引物,从中筛选获得26对CAPS标记引物,开发成功率为66.7%,其中11对CAPS标记具有多态性,多态性比例为43.2%。(3)开发的CAPS标记能较好地将12份不同类型的黄麻种质区分开来,表明CAPS是适用于黄麻研究的较理想的分子标记方法,为黄麻遗传基础研究提供了可靠工具。

萝卜自交不亲和基因SLG6的CAPS标记的开发

萝卜是我国的主要蔬菜之一,其杂种优势十分明显,培育自交不亲和系是萝卜杂种优势育种的主要途径之一。本研究根据萝卜自交不亲和基因SLG6序列设计特异引物,以8个自交系为材料,其中自交不亲和系和自交亲和系各4个,扩增SLG6基因第232～711bp之间的单拷贝片段,8个材料均获得了一条480bp的特异片段。用限制性内切酶TaqⅠ对该片段进行酶切,自交不亲和系均产生约125bp和244bp的片段,其中,244bp的片段为自交不亲和系所特有,可作为SLG6基因的CAPS标记用于萝卜自交不亲和基因SLG6的检测;而自交亲和系则具有与自交不亲和系相同的125bp的片段和不同的多态性片段。

大豆胞囊线虫主效抗病基因Rhg4(GmSHMT)的CAPS/dCAPS标记开发和利用

大豆胞囊线虫(soybean cyst nematode,SCN)严重危害世界大豆生产,Rhg4(resistance to Heterodera glycines 4)是控制大豆SCN抗性的2个主效位点之一。本研究针对Rhg4(Gm SHMT)上的2个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)位点开发了快速、经济、简便易行的CAPS(Rhg4-389)和d CAPS标记(Rhg4-1165),并用开发的2个标记鉴定了以大豆胞囊线虫应用核心种质为主的193份代表性抗感种质。结果表明,Rhg4-389和Rhg4-1165位点间存在显著连锁不平衡(P=0.0001,r2=0.87),可形成4种单倍型。Rhg4-389-G/Rhg4-1165-T和Rhg4-389-C/Rhg4-1165-A为优势单倍型,稀有单倍型Rhg4-389-G/Rhg4-1165-A和Rhg4-389-C/Rhg4-1165-T是在中国抗源中新发现的单倍型。结合193份种质对SCN 3号小种抗性鉴定分析发现,Rhg4-389-G和Rhg4-1165-T主要存在于抗病种质,它们形成的单倍型对抗病种质鉴定效率可达94.1%。本研究开发了可用于辅助大豆SCN抗性鉴定且方便育种家利用的CAPS/d CAPS标记,且用其摸清了应用核心种质等重要抗源在Rhg4位点的"本底",为育种家有效利用这些优异抗源提供了重要信息。

M342抗除草剂基因CAPS标记的开发与应用

M342是利用EMS诱变定向选育获得的甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂新种质。通过M342抗性基因与敏感型油菜的ALS基因序列分析结果表明,M342的BnALS3基因存在1处SNP突变,导致编码的蛋白质第556位色氨酸突变为亮氨酸,该突变导致基因序列对BsrD I内切酶消化的差异。为此设计了8条引物,从中筛选到引物对SU54F/SU58R在不同油菜品种中可以特异性扩增出目的片段,该片段经BsrD I酶切分型正确,从而开发了检测M342中抗性基因BnALS3R的CAPS标记。运用该标记对除草剂敏感型油菜、纯合抗性油菜及杂合抗性油菜BnALS3的基因型进行验证,并应用该标记对F_2、BC_1分离群体进行检测。结果表明,该标记验证的基因型结果与测序结果一致。F_2分离群体有Als3Als3、Als3als3、als3als3 3种基因型,BC_1分离群体有Als3als3、als3als3 2种基因型,与表型鉴定结果一致,遵循单基因遗传分离规律,表明该标记可以应用于抗性基因的检测。CAPS标记的获得为抗除草剂油菜的分子标记辅助选择育种奠定了基础。

白菜类作物开花时间相关基因BraA.FLM.a的CAPS标记开发与利用

[目的]本文旨在研究白菜类作物开花时间候选基因BraA.FLM.a的酶切扩增多态性序列(CAPS)标记开发与利用。[方法]PCR扩增2个亲本的BraA.FLM.a基因外显子2到内含子2区域的特异序列,开发CAPS标记BraA.FLM.a-NlaⅢ,用CAPS标记对F2分离群体的基因型进行检测,并进行Pearson相关性分析研究基因型与开花时间表现型的关系。[结果]通过调查亲本早开花油用型品种‘Yellow sarson’材料YS-143和晚开花芜菁品种‘Vegetable turnip’材料VT-044的开花时间和F2群体的开花时间,发现两亲本的开花时间存在显著性差异。通过PCR扩增克隆了两亲本的BraA.FLM.a基因的特异序列,并在突变位点T-A处开发出CAPS标记BraA.FLM.a-NlaⅢ。在136份F_2分离群体上进行此CAPS标记的验证后,发现T基因型开花时间晚于A基因型的开花时间,并且差异显著(P<0.05)。[结论]BraA.FLM.a基因的CAPS标记BraA.FLM.a-NlaⅢ与开花时间表型显著相关,该标记可以用作开花时间的分子选择辅助育种。

大豆MIPS1基因的定位及其低植酸突变性状CAPS标记的开发

【目的】定位大豆肌醇-3-磷酸合成酶基因MIPS1,丰富该基因的遗传信息;开发出该基因的特异性分子标记,用于大豆突变体Gm-lpa-TW-1低植酸(LPA)突变性状的辅助选择。【方法】应用公布的大豆基因组数据库和生物信息学分析确定MIPS1候选染色体,利用分离群体中微卫星标记与LPA性状的共分离,定位突变基因MIPS1;根据MIPS1LPA突变性质和同源基因的序列,开发CAPS分子标记。【结果】大豆中有4个MIPS基因,其中MIPS1被定位在染色体18上,为注释为Glyma18g02210的大豆基因,其DNA起始序列为1364774bp,位于SSR标记Satt570(3162690 bp)和Satt115(10422881 bp)之上,遗传距离分别为5.5和15.2cM;开发了MIPS1特异性共显性CAPS标记,与LPA性状完全共分离。【结论】本文首次确定了MIPS1所在染色体及其位置,丰富了该基因的遗传信息,开发的CAPS标记可用于Gm-lpa-TW-1LPA性状的分子标记辅助选择。