53基因及CAR受体对ONYX-015肿瘤杀伤作用的影响

目的:利用肿瘤特异性增殖型腺病毒ONYX-015分别感染具有柯萨奇病毒和腺病毒联合受体(CAR)水平正常、p53正常或突变的,以及CAR水平低下、p53突变的肿瘤细胞株,研究ONYX 015对这些肿瘤细胞的特异性增殖及杀伤能力。方法:以正常的肝细胞株L02作为对照,用细胞病变效应(CPE)实验观察ONYX-015对细胞的选择性杀伤效应;病毒增殖实验检测野生型腺病毒(Ad5)、ONYX 015在多种肿瘤细胞中的增殖能力。结果:ONYX 015对正常的肝细胞L02无杀伤性,但能够有效地杀伤p53突变的肝癌细胞Hep3B、p53正常的肝癌细胞HepG2及肺癌细胞A549,不能杀伤p53突变的人乳腺癌细胞株MDA-MB 231。在CAR受体水平正常的癌细胞株Hep3B、HepG2和A549中,Ad5和ONYX-015均可增殖。在CAR受体水平低下、p53突变的人乳腺癌细胞株MDA-MB 231中,两种病毒均不增殖。结论:CAR受体对ONYX-015的增殖力起着至关重要的作用。在CAR受体水平正常的前提下,无论肿瘤细胞的p53基因正常与否,ONYX-015均可以有效增殖并杀伤细胞;相反,如果CAR受体水平低下,即使该种肿瘤细胞p53基因突变,ONYX-015在该细胞中的增殖力也会受到限制。ONYX-015不杀伤CAR受体及p53基因均正常的正常肝细胞。

茵栀黄对结构性雄甾烷受体CAR介导CYP3A4的转录调节作用

目的:探讨茵栀黄对CYP3A4转录表达的影响及机制。方法:Chang Liver细胞中加入0.01、0.1和1μM茵栀黄分别作用24h、36h和48h,采用RT-PCR法和报告基因方法检测CYP3A4 m RNA的表达水平。结果:不同浓度茵栀黄分别处理Chang Liver细胞24h和36h可明显升高CYP3A4 m RNA的表达水平(P<0.05);转入CAR载体的Chang Liver细胞经不同浓度茵栀黄处理36h均可激活CYP3A4的转录表达。结论:茵栀黄可能通过CAR介导增加Chang Liver细胞CYP3A4的转录表达。

嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK)的研究进展

自然杀伤(NK)细胞是一类重要的固有免疫细胞,也是人体抵御病原体入侵和细胞恶变第一道防线的重要组成部分。嵌合抗原受体(CAR)基因修饰细胞是近年来免疫治疗领域的研究热点,关于CAR-T免疫治疗的临床试验已取得了很好的疗效,但也存在一些弊端。CAR介导的NK细胞抗肿瘤活性已有很多报道,包括NK细胞系,从外周血中分离出的NK细胞,以及从人多能干细胞中衍生出的NK细胞。目前也已有CAR-NK临床研究获得批准。我们总结了CAR-NK的相关研究进展。

柯萨奇病毒腺病毒受体的表达对基因工程腺病毒抗瘤活性的影响

背景与目的:腺病毒是研究最多的一种溶瘤病毒,也是基因治疗最常用的一种载体,但作为溶瘤病毒或载体,其治疗恶性肿瘤的疗效很大程度上受到组织器官表达柯萨奇病毒腺病毒受体(Coxsackieandadenovirusreceptor,CAR)的影响。本研究旨在观察CAR表达对腺病毒感染力及临床疗效的影响。方法:收集29例基因工程腺病毒(H101)临床试验患者的病理标本,用免疫组织化学法检测CAR表达,分析CAR表达与临床疗效的关系。体外通过流式细胞仪检测不同肿瘤细胞表面CAR表达,用MTT法测定病毒对不同细胞的抑制率,以观察CAR表达与H101感染力的关系。结果:29例恶性肿瘤患者中,10例有效病例CAR阳性表达者7例(70.0%),19例无效病例CAR阳性表达仅6例(31.6%),CAR表达与临床疗效呈显著性相关(P=0.048)。体外实验结果显示,不同肿瘤细胞株CAR的表达存在差异,其表达量与H101对细胞的感染力(病毒对肿瘤细胞抑制率)呈正相关(r=0.986)。结论:CAR的表达与腺病毒的感染力及临床疗效密切相关,CAR高表达的肿瘤对腺病毒治疗的疗效较低表达者明显为好。

膀胱癌细胞CAR的表达对E1B缺失腺病毒抗瘤活性的影响

【目的】观察不同组织类型膀胱癌细胞株表达柯萨奇病毒腺病毒受体(coxsackieandadenovirusreceptor,CAR)与E1B缺失腺病毒(H101)体外感染力及体内抗瘤活性的关系。【方法】体外通过流式细胞仪法(FCM)检测不同组织类型膀胱癌细胞株表面CAR表达,用MTT法测定病毒对它们的抑制率,以观察CAR表达与H101感染力的关系;利用裸鼠移植瘤模型,观察H101对不同移植瘤的抗瘤活性。【结果】膀胱癌细胞上CAR的表达量与H101的感染力呈正相关(r=0.952);动物移植瘤实验结果显示,H101对CAR表达高的SCaBER移植瘤的抑制率较高,有效持续的时间也较长。【结论】膀胱癌细胞株上不同的CAR表达可直接影响H101的体内外抗瘤活性。

CAR在乳鼠肠、肝、心、脑、肾、肺组织的表达

目的检测柯萨奇-腺病毒受体(CAR)在乳鼠肠、肝、心、脑、肾、肺组织中的表达变化,为研究CVB感染引发病毒性疾病与组织中CAR表达水平的关联性提供参考。方法采用荧光实时定量PCR和Western blot法测定正常BALB/c乳鼠肠、肝、心、脑、肾、肺组织中CAR受体在核酸水平和蛋白水平的相对表达量。结果定量PCR显示CAR在乳鼠脑、肺、肠组织中表达显著高于肝、肾、心组织,差异均有显著性(P<0.01)。Western blot检测发现与定量PCR结果基本一致。结论 CAR的表达存在组织特异分布的特点。

受体依赖性TRAIL重组腺病毒对人肺癌细胞凋亡的诱导作用

目的:观察重组TRAIL腺病毒(Ad5-TRAIL及Ad5F35-TRAIL)对人非小细胞肺癌(nonsmall-cell lung cancer,NSCLC)原代培养细胞和细胞株的凋亡诱导作用,探讨两种Ad-TRAIL用于肺癌基因治疗的价值。方法:采用流式细胞术检测人肺癌细胞系A549、Z793、QG56和NCI-H520及10例原代培养肺癌细胞中CAR和CD46的表达水平;分别以Ad5-TRAIL及Ad5F35-TRAIL重组腺病毒按MOI 10和50感染上述细胞,48 h后Annexin V-FITC双标法流式细胞术检测细胞的早期凋亡。结果:A549、Z793、QG56和NCI-H520 4株肺癌细胞中,CD46的表达均明显高于CAR表达。Z793、QG56细胞对Ad5-TRAIL和Ad5F35-TRAIL的作用较敏感,MOI=10感染后凋亡率分别为(11.76±2.10)%、(15.96±2.89)%和(6.05±1.58)%、(10.11±1.26)%,显著高于对照组[(2.33±0.37)%和(5.95±1.89)%,P<0.05];MOI=50感染时NCI-H520细胞凋亡率分别为(12.89±3.2)%和(9.08±1.35)%,与对照组(7.04±2.17)%相比差异无统计学意义(P>0.05);Ad5-TRAIL和Ad5F35-TRAIL均不能诱导A549细胞凋亡。10例原代肺癌细胞CD46表达也明显较CAR高;Ad5-TRAIL或Ad5F35-TRAIL感染后,5例的原代肺癌细胞检测到凋亡;与Ad5-TRAIL相比,Ad5F35-TRAIL诱导的凋亡率更高。结论:两种TRAIL重组腺病毒对非小细胞肺癌细胞均有凋亡诱导作用,Ad5F35-TRAIL的作用强于Ad5-TRAIL,更适合于非小细胞肺癌的基因治疗。

靶向PD-L1的嵌合抗原受体修饰的NK-92细胞具有抗A549肺癌细胞增殖活性

目的 探究靶向程序性死亡蛋白1配体1(PD-L1)的嵌合抗原受体修饰的NK-92细胞在肺癌中的抗肿瘤活性。方法利用慢病毒感染获得嵌合抗原受体修饰的NK-92细胞(pCAR-92);使用γ干扰素(IFN-γ)诱导肿瘤细胞过表达PD-L1,通过检测乳酸脱氢酶(LDH)的释放水平表征pCAR-92细胞对靶细胞A549细胞的细胞毒性,流式细胞术检测pCAR-92细胞中CD107a以及IFN-γ的水平来反映激活状态,通过IFN-γ诱导后的A549细胞NCG小鼠皮下移植建立异种移植瘤模型以验证pCAR-92细胞的体内抗肿瘤活性。结果 流式细胞术检测pCAR-92细胞的感染阳性率为70%~80%,与对照组相比,LDH结果显示pCAR-92细胞可以显著裂解经过IFN-γ诱导的A549细胞,此外,CD107a表达显著上调;pCAR-92细胞与IFN-γ诱导的A549细胞共孵育后;与对照组相比,pCAR-92细胞具有更强的抗移植瘤生长能力,且经pCAR-92细胞治疗后肿瘤部位PD-L1的表达降低,肿瘤浸润自然杀伤(NK)细胞的数量增加。结论 靶向PD-L1的嵌合抗原受体修饰的NK-92细胞具有明显抗肿瘤效果。

组成性雄烷受体遗传多态性与个体化治疗

组成性雄烷受体(constitutive androstane receptor,CAR)通过调控细胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)等一相代谢酶、UDP-葡萄糖醛酸转移酶(UDP-glucuronosyltransferases,UGTs)等二相代谢酶及多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated protein,MRP)等药物转运体等代谢相关基因,对外源性药物代谢及维系体内血糖、血脂、胆红素等多种内源性物质的代谢平衡发挥重要作用。作为体内物质代谢的枢纽,CAR直接影响了代谢性疾病的发生以及多种药物的疗效,对其多态性的研究有利于从基因层面解释个体化治疗的差异性,预见相关疾病的发生进展。本文拟就近几年来CAR单核苷酸多态性影响物质代谢的相关研究作一综述,探究CAR多态性与物质代谢的相关性,为临床上疾病的发生及药物用法用量的提前预测提供科学依据。

嵌合抗原受体调节性T细胞免疫疗法在器官移植中的应用

调节性T细胞(Treg)是对机体进行免疫负调控的一类T细胞亚群,具有抑制排斥反应的作用。通过嵌合抗原受体(CAR)技术对Treg进行特异性的改造,可以成功地将供体特异性抗原嵌合到Treg表面,从而实时调节机体的免疫功能,为诱导免疫耐受提供了一种新颖而有前景的治疗选择。本文综述了Treg在免疫相关疾病中的研究、CAR-Treg技术实现的主要难点及其在诱导器官移植免疫耐受方面的研究进展,展望了CAR-Treg在器官移植领域应用的机会与挑战。

PSMA-CAR慢病毒表达载体的包装研究

目的前列腺特异性膜抗原-嵌合抗原受体(PSMA-CAR)慢病毒表达载体的包装方法研究。方法采用慢病毒三质粒病毒包装系统(Del8.9+VSVG、PsAX2+OG)及包装细胞(HEK-293T、HEK-293FT)在转染试剂[聚乙烯亚胺(PEI)、Lipofectamine 2000、磷酸钙]的介导下,包装慢病毒颗粒。通过检测转染效率筛选最佳包装细胞、最佳包装质粒组合、最佳转染试剂和剂量。结果 HEK-293FT细胞的转染效率高于HEK-293T细胞的转染效率。PsAX2+OG组合的转染效率高于Del8.9+VSVG组合的转染效率。PEI方法转染时,包装质粒相同,空载体的转染效率明显要高很多;目的质粒相同,采用包装质粒为PsAX2+OG组合时,转染效率更高;数据统计表明,质粒总量∶PEI的比例在1∶9时转染效率更高。Lipofectamine 2000方法转染时,包装质粒和包膜质粒相同,空载体的转染效率更高;目的质粒和包装、包膜质粒相同,质粒总量∶Lipofectamine 2000的比例在1.0∶2.0和1.0∶2.5时转染效率显著高于其他两组比例。磷酸钙转染法时,随着加入的磷酸钙的增多,转染效率呈递减趋势。结论采用包装质粒PsAX2和包膜质粒OG时转染效率相对更高。质粒总量和加入的PEI量比例在1∶9时转染效率更高;质粒总量和加入的Lipofectamine 2000量比例在1.0∶2.0和1.0∶2.5时转染效率更高。PEI包装法和Lipofectamine 2000包装法转染效率相当,Lipofectamine 2000包装法相对高一些,但在考虑包装成本的前提下后续大量包装PSMA-CAR慢病毒颗粒时,应选择PEI包装法。

识别乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的嵌合抗原受体NK92MI细胞的制备

目的构建识别乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的嵌合抗原受体(CAR)慢病毒表达载体,并使其在NK92MI细胞表达,制备识别HBsAg的CAR-NK92MI细胞。方法根据单链抗体(scFv)的序列,设计并合成CAR,构建慢病毒表达载体,将其包装、浓缩、测定滴度。然后用浓缩的慢病毒感染HEK293T细胞、Western blot法验证CD3ζ链的表达及在NK92MI细胞中的感染效率。结果成功构建识别HBsAg的CAR慢病毒表达载体,测得滴度≥10^(7)转导单位(TU)/mL。感染NK92MI细胞后,可表达CD3ζ蛋白。结论成功制备了识别HBsAg的CAR-NK92MI细胞。

NKG2D CAR-NK92细胞构建及其对多发性骨髓瘤细胞的杀伤作用

目的 构建并鉴定靶向自然杀伤细胞2组成员D配体(NKG2DL)的嵌合抗原受体NK92(CAR-NK92)细胞[分泌白细胞介素15受体a与白细胞介素15的复合物(IL-15Ra-IL-15)],并验证NKG2D CAR-NK92细胞对多发性骨髓瘤细胞的杀伤活性。方法 通过筛选NKG2D的胞外段连接4-1BB、 CD3ζ、 IL-15Ra-IL-15序列构建CAR载体,包装慢病毒并转导NK92细胞,获得NKG2D CAR-NK92细胞;CCK-8法检测NKG2D CAR-NK92细胞的增殖能力,ELISA检测其IL-15Ra的分泌,乳酸脱氢酶(LDH)法检测其杀伤效率;流式细胞术检测细胞活化性受体NK细胞受体p30(NKp30)、 NKp44、 NKp46的表达,凋亡细胞群的比例以及CD107α表达、胞内颗粒酶B(granzyme B)和穿孔素(perforin)的释放,以进一步验证NKG2D CAR-NK92细胞对肿瘤的细胞毒性作用机制;通过NKG2D抗体抑制效应细胞、组胺抑制肿瘤细胞后,LDH法检测对细胞杀伤效率的影响;构建NCG(NOD-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Nju)小鼠多发性骨髓瘤异体移植模型,验证其体内抗肿瘤活性。结果 慢病毒转导后,NK92细胞的NKG2D表达显著增加;与NK92细胞相比,NKG2D CAR-NK92细胞的增殖能力稍弱,早期凋亡细胞群少于其亲本NK92细胞;NKG2D CAR-NK92对多发性骨髓瘤细胞的细胞毒性更强,在其培养上清液中可检测到IL-15Ra的分泌;NKp44蛋白在NKG2D CAR-NK92细胞上的表达量显著增加,活化效应增强;抑制试验显示,CAR-NK92细胞对MHC-Ⅰ类链相关蛋白A(MICA)和MICB阳性的肿瘤细胞的细胞毒性作用更依赖于NKG2D CAR和NKG2DL的相互作用;NKG2D CAR-NK92细胞经肿瘤细胞刺激后,granzyme B和perforin表达增加,且NK细胞显著上调CD107α的表达;在高度免疫缺陷NCG小鼠多发性骨髓瘤异体移植模型中,经NKG2D CAR-NK92细胞治疗的小鼠肿瘤明显缩小,且体质量无明显下降。结论 成功构建一种靶向NKG2DL的CAR-NK92细胞(分泌IL-15Ra-IL-15),其对多发性骨髓细胞的杀伤作用明显。

不同信号肽对嵌合抗原受体T细胞杀伤作用的影响研究

背景与目的:信号肽(signal peptide,SP)是一段存在于前体蛋白N-端的短肽链,能够调节前体蛋白的折叠和转移,在蛋白质的分泌过程中扮演着极其重要的角色。近年来,靶向CD19的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)T细胞在白血病治疗中取得了重大突破,关于CAR结构的胞内域改造方面也有诸多研究,而对单链可变片段(scFv)的N端SP研究进展缓慢。探讨4种不同SP的CD19-CAR在T细胞表面表达及对CD19+靶细胞的杀伤作用。方法:通过基因合成和分子克隆技术,构建含4种不同SP(SP1、SP2、SP3、SP4)的靶向CD19抗原的CAR载体,进行慢病毒包装,将得到的慢病毒转染T细胞,利用流式细胞术检测细胞转染效率,采用钙黄绿素释放法检测该细胞对靶细胞的杀伤作用,采用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞因子IFN-γ和TNF-α的分泌水平。结果:成功构建4种不同SP的重组慢病毒载体,将4种慢病毒转导T细胞后,结果显示,分别有20.9%、22.6%、31.5%、38.6%的T细胞表面能够表达CD19-CAR(分别命名为SP1-CD19、SP2-CD19、SP3-CD19和SP4-CD19细胞),进一步杀瘤实验证明,SP4-CD19细胞对CD19+肿瘤细胞的杀伤作用显著高于SP1-CD19、SP2-CD19和SP3-CD19细胞(P<0.01),并且当效靶比为10∶1共培养24 h后,与SP1-CD19、SP2-CD19和SP3-CD19细胞相比,SP4-CD19细胞的IFN-γ和TNF-α的分泌水平显著升高(P<0.05)。此外,4种不同SP的CAR-T对CD19-肿瘤细胞K562的杀伤作用差异无统计学意义(P>0.05)。结论:SP4-CD19细胞的转染效率、细胞因子分泌水平及对CD19+肿瘤细胞的杀伤作用均显著高于SP1-CD19、SP2-CD19和SP3-CD19细胞,该研究成果为CAR-T优化改造及其高效的临床应用奠定了科学基础。

T细胞活力响应性启动子(TARP)萤光素酶报告系统在CAR⁃T细胞功能鉴定中的应用

目的将T细胞活力响应性启动子(TARP)纳米萤光素酶报告基因系统导入含有嵌合抗原受体(CAR)编码基因的慢病毒质粒中,为CAR⁃T细胞活化水平及功能鉴定提供一种便捷的、定量分析的方案。方法采用全基因合成及分子克隆技术构建重组质粒。慢病毒包装并感染人原代T淋巴细胞,流式细胞术检测慢病毒感染T细胞的阳性率。通过萤光素酶报告基因系统、Western blot法、流式细胞术、小动物活体成像技术鉴定CAR⁃T细胞的功能。结果酶切鉴定和质粒测序结果表明重组质粒的顺利构建,流式细胞术结果显示CAR⁃T细胞的正常制备,萤光素酶活力检测结果表明本系统能够动态响应CAR⁃T细胞的激活,体外功能实验证实本系统能够反映CAR⁃T细胞的耗竭状态,小动物活体成像结果体现了本系统在小鼠体内的示踪功能。结论TARP纳米萤光素酶报告基因系统为评估CAR⁃T细胞活化水平,耗竭状态以及体内示踪等方面提供了更加便捷、灵敏、定量分析的技术手段。

胞外Ca^(2+)信号——动植物中的第一信使

钙离子作为重要的胞内第二信使,控制着许多细胞的功能,人们对此已经研究得比较深入。然而最近发现的一些细胞表面胞外Ca2+探测器使我们想到是否在胞外环境中,钙离子也具有信号分子的功能。钙离子传感器包括已经研究得比较清楚的胞外Ca2+敏感受体—最初从甲状旁腺分离的G-耦联蛋白受体(CaR),另外,还有其他受体、通道和膜蛋白也都对胞外[Ca2+]的变化很敏感。最近从拟南芥保卫细胞中克隆到一个胞外钙离子受体蛋白(CAS),通过胞外钙离子的变化引起胞内钙离子信号。这些受体蛋白的克隆,使人们确信Ca2+在细胞中可以发挥第一信使的功能。

携带EGFP报告系统的五型腺病毒对肝癌干细胞的感染效率

利用携带EGFP报告系统的五型腺病毒(Ad5-EGFP)作为工具,以发生上皮-间质转化(epithelial-mes-enchymal transition,EMT)前后的肝癌细胞系Huh7为研究对象,采用流式细胞仪、荧光定量PCR等技术开展腺病毒对发生EMT前后的肝癌细胞系Huh7的感染效率的对比研究。实验结果表明:Ad5-EGFP对上皮生产因子β1(TGF-β1)处理前的Huh7细胞系感染率比TGF-β1处理后的细胞系感染率更高。同时Ad5-EGFP的主要受体-CAR在肝癌细胞系Huh7发生EMT后表达有所降低。证实了肿瘤干细胞更难被腺病毒侵染,为了适应临床治疗的需要,腺病毒作为基因治疗的载体需要进一步被改造。

5型腺病毒载体与血小板减少的研究进展

腺病毒有两种属性：首先它们是普遍存在的病原体,机会性的引起威胁生命的疾病;其次也可以加工成为有效的转基因载体.然而,在进行腺病毒载体基因治疗时会引起血小板减少,但是其机制仍然不明.该文章的目的 在于总结目前关于5型腺病毒载体基因治疗后导致血小板减少的可能机制,为腺病毒载体的安全应用提供参考.

从基础研究到临床实践:调节性T细胞在移植免疫耐受中的应用研究进展

调节性T细胞(Treg)是机体建立免疫耐受的重要抑制性免疫细胞,在调控机体过度免疫应答和自身免疫性疾病中发挥着重要作用。在移植免疫耐受相关研究中,增加体内Treg数量或增强其功能已被证明是一种能够诱导移植免疫耐受的治疗策略。目前,基于Treg诱导移植免疫耐受的方法包括过继输注Treg、体内扩增Treg和利用抗原特异性Treg。本文对Treg的特征及其作用机制,基础实验最新研究进展及国内外与移植免疫耐受相关的Treg临床实践进行综述,并对Treg治疗未来的挑战与发展进行展望,旨在揭示Treg在移植免疫耐受相关研究中的重要性和应用前景,探讨Treg治疗策略的优势和局限性,并为今后该领域的研究提供参考依据和启示。

多发性骨髓瘤中CAR-T细胞疗法研究进展

多发性骨髓瘤(MM)是一种血液系统浆细胞克隆增殖的恶性肿瘤,传统的治疗治疗模式蛋白酶体抑制剂(PI)、免疫调节药物、单克隆抗体、干细胞移植等改善了大多数患者的预后,但肿瘤耐药性会导致疾病复发。复发/难治性MM(RRMM)患者预后差,对这部分患者目前无令人满意的有效治疗方案,新型治疗方案正在积极开发中,早期研究表明,嵌合抗原受体-T细胞(CAR-T)疗法对RRMM患者具有显著疗效,然而,持久反应尚未实现。在本综述中,总结了多发性骨髓瘤中CAR-T细胞疗法的原理、可选靶点及克服治疗失败的策略。