靶向CD19抗原的CAR-NK-92MI和CAR-CD19-T细胞对套细胞淋巴瘤的体外杀伤

目的:探讨靶向CD19抗原的CAR-NK-92MI和CAR-CD19-T细胞对套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma,MCL)的体外杀伤作用。方法:利用近年来在B细胞急性淋巴细胞白血病(B-lineage acute lymphoblastic leukemia,B-ALL)临床试验中获得的成功嵌合抗原受体基因修饰的T(CAR-T细胞)技术,针对MCL高表达CD19抗原的情况,分别构建了靶向CD19抗原的CAR-CD19-T和CAR-NK-92MI细胞,运用LDH释放法检测两者对MCL细胞的体外杀伤作用,另外通过流式细胞术对其杀伤作用进行了验证。结果:相对于对照,无论是CAR-NK-92MI细胞还是CAR-CD19-T细胞,都对MCL细胞具有极高的杀伤能力(均P<0.01),都对K562-CD19细胞具有非常高的毒性(均P<0.01),而对K562细胞基本不起作用。CAR-NK-92MI细胞组MCL细胞的死亡率比对照组高30%~40%,CAR-CD19-T细胞组MCL细胞的死亡率比对照组高40%~50%。结论:CAR-NK-92MI和CARCD19-T细胞在体外对MCL细胞具有强的特异性杀伤作用。

CD19和CD22双靶点CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用

目的:设计并制备一种分别靶向B细胞表面抗原CD19和CD22的CAR-T细胞,检测其对肿瘤细胞的体内外杀伤效果。方法:将含有人源化CD19 Sc Fv的二代CAR分子和带有CD3ε链作为共刺激结构域的CD22 Sc Fv CAR分子以P2A自剪切肽连接,序列连接于慢病毒载体p LTR-CMV-MCS中,以HEK-293T细胞包装相应的慢病毒载体,感染健康志愿者提供的T细胞制备CAR-19-22-T细胞,同时以相同二代结构分别构建单靶向CAR-T细胞作为参照。构建表达荧光素酶、CD19和/或CD22的前列腺癌3M细胞(靶细胞)。将各种CAR-T细胞与靶细胞共同培养,采用荧光素酶化学发光法和ELISA法检测其对靶细胞的杀伤能力和细胞因子的分泌水平。通过尾静脉注射Raji-Luc细胞构建NOD-SCID免疫缺陷小鼠白血病模型,分别注射各组CAR-T细胞进行治疗并评估其疗效。结果:培养7 d的CAR-19-22-T细胞的CAR-19表达率为13.7%,CAR-22表达率为14.3%。CAR-19-22-T细胞在10∶1效靶比时,对3M-CD19-Luc、3M-CD22-Luc和3M-CD19-CD22-Luc细胞的杀伤率均显著高于T细胞[(78.1±14.4)%vs(11.1±4.3)%(、46.7±10.7)%vs(12.4±2.7)%(、90.5±4.3)%vs(14.3±3.7)%,均P<0.01];与3M-CD19-Luc、3M-CD22-Luc、3M-CD19-CD22-Luc靶细胞共培养后,CAR-19-22-T细胞IFN-γ、TNF-α和IL-2水平均显著低于CAR-19-T和CAR-22-T细胞(P<0.05或P<0.01)。CAR-19-22-T细胞对移植Raji-Luc细胞模型小鼠治疗效果明显,其生存期显著长于T细胞组(P<0.01),与CAR-19-T组和CAR-22-T组荷瘤小鼠比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论:成功设计并制备了一种双靶点CAR-19-22-T细胞,其能够有效杀伤表达CD19和/或CD22抗原的肿瘤细胞,对Raji-Luc细胞的白血病模型小鼠有显著的治疗效果。

CD19-CAR-T细胞治疗难治复发急性淋巴细胞白血病的研究进展

难治复发急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia,ALL)预后差,生存期短,其治疗已成为国际难题。嵌合抗原受体基因修饰T(chimeric antigen receptor gene-modified T,CAR-T)细胞是目前最具应用前景的靶向免疫治疗,靶向CD19的CAR-T细胞(CD19-CAR-T)治疗儿童及成人难治复发性ALL的完全缓解率(complete remission,CR)可达90%以上,疗效远高于化疗。然而,细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome,CRS)、严重神经毒性(serious neurotoxicity,SNT)、脱靶效应以及疾病复发等严重限制了CAR-T细胞的进一步临床应用。本文主要阐述CAR-T细胞的制备技术、预处理方案、细胞输注剂量及各种并发症防治策略等最新研究进展。

CD19 CAR-T细胞治疗骨髓侵犯B细胞淋巴瘤疗效分析

目的:探讨抗CD19 CAR-T细胞治疗骨髓侵犯的复发难治B细胞非霍奇金淋巴瘤(R/R B-NHL)患者的疗效和不良反应。方法:对2017年11月至2018年5月郑州大学第一附属医院肿瘤科收治的5例骨髓侵犯的R/R B-NHL患者应用抗CD19 CAR-T细胞治疗,观察疗效及不良反应。结果:输注后28 d评估近期疗效,并进行骨髓检查,4例患者取得完全缓解(CR)和微小残留病变(MRD)转阴,1例患者取得部分缓解(PR),骨髓活检显示均无淋巴瘤骨髓侵犯。5例患者均发生细胞因子释放综合征(CRS),4例患者发生2级CRS,1例患者发生4级CRS,治疗后均得到控制,中位随访时间18(12~19)个月,5例患者均无复发。结论:抗CD19 CAR-T细胞治疗伴随骨髓侵犯的R/R B-NHL患者长期疗效良好,不良反应可控。

共表达细胞因子IL-7和趋化因子CCL19/CCL21的第4代anti-CD19 CAR-T细胞的开发与应用

目的初步探讨共表达细胞因子IL-7和趋化因子CCL19或CCL21的anti-CD19 CAR-T细胞的功能特性及其在体外对人CD19^+急性淋巴细胞白血病(B-ALL)的杀伤效果,旨在优化CAR-T细胞各项功能,增强其对血液瘤、实体瘤的治疗效果。方法通过亚克隆技术获得重组慢病毒质粒,慢病毒包装,转导原代T细胞获得2种第4代anti-CD19CAR-T细胞,分别命名为7×19 CAR-T细胞、7×21 CAR-T细胞。借助流式细胞仪和相关试剂盒检测了细胞CAR分子的转导效率、CAR-T细胞的趋化能力、增殖及凋亡情况等;钙黄绿素释放法检测CAR-T细胞的杀伤作用;共培养法检测CAR-T细胞因子的释放情况;2种第4代anti-CD19 CAR-T细胞组皆于原代T细胞、常规anti-CD19 CAR-T细胞作比较。结果7×19 CAR-T、7×21 CAR-T细胞的功能特性皆有显著提高,主要表现在细胞增殖速度加快、细胞凋亡速率明显变慢、炎症因子IFN-γ、肿瘤坏死因子TNF-α的分泌量皆有所增加;且体外杀伤实验表明阳性率约40%的7×19 CAR-T、7×21 CAR-T细胞对CD19^+肿瘤细胞Raji的杀伤效率高于阳性率约50%anti-CD19 CAR-T细胞(P<0.01);结论实验数据显示共表达细胞因子IL-7和趋化因子CCL19或CCL21的第4代anti-CD19 CAR-T细胞即7×19 CAR-T和7×21 CAR-T细胞相比第3代anti-CD19 CAR-T细胞和T细胞在趋化能力、细胞增殖、细胞凋亡、体外杀瘤效果以及细胞炎症因子的释放能力等方面皆有显著改善,初步证明了7×19 CAR-T细胞和7×21 CAR-T细胞的各项功能有所优化,对CD19^+人急性淋巴细胞白血病治疗效果得到改善,为开发靶向CD19的新型CAR-T细胞提供了新思路,这种模式也为其它类型CAR-T细胞的开发开创了典范。

金银花提取物增强抗CD19 CAR-T细胞肿瘤杀伤活性

目的探究金银花提取物对抗CD19 CAR-T细胞肿瘤杀伤活性以及细胞因子释放的影响。方法利用抗CD19 CAR-T细胞与肿瘤细胞Raji细胞(或Raji-Luc细胞)共培养体系,通过荧光素酶与凋亡检测法测定对照组与金银花处理组的抗CD19 CAR-T细胞的杀伤效率;采用CFSE染色法检测增殖能力,并通过流式细胞术测定细胞因子的释放水平与PD-1蛋白的表达水平。结果T细胞转导组CD19 CAR分子的表达率为65.7%,表明抗CD19 CAR-T细胞制备成功。10 mg·mL^(-1)金银花提取物与抗CD19 CAR-T细胞联合组杀伤Raji细胞的效力最佳,且优于CD19 CAR-T细胞组、金银花与未转导T细胞联合组、未转导T细胞组与金银花处理组。并且在1∶2、1∶4、1∶8与1∶16效靶比条件下,金银花提取物均可以增强抗CD19 CAR-T细胞的肿瘤杀伤能力,改善抗CD19 CAR-T细胞的增殖能力,促进Granzyme B的分泌而抑制IFN-γ与IL-10的释放。进一步研究发现,金银花提取物可以抑制CD19 CAR-T细胞表达PD-1蛋白。结论10 mg·mL^(-1)的金银花提取物可以有效提高抗CD19 CAR-T细胞体外杀伤肿瘤的效力,促进抗CD19 CAR-T细胞增殖,并特异性调节细胞因子的释放,下调PD-1蛋白的表达。

第二代CD19-CAR-T细胞治疗难治复发急性B淋巴细胞白血病的经验及问题

为了探索抗CD19嵌合抗原受体基因修饰T(CD19-CAR-T)细胞治疗难治、复发的B急性淋巴白血病(B-acute lymphoblastic leukemia,B-ALL)安全有效的细胞剂量、毒副作用及其处理方法,2015年7月12日至2016年11月20日,笔者团队采用CD19-CAR-T细胞治疗了64例难治复发B-ALL患者。其中55例为原发耐药或难治性血液学复发患者,9例为FCM确认的难治性微小残留白血病(minimal residual disease,MRD)阳性B-ALL患者。在治疗工作早期,2例死于治疗后相关并发症(treatment related motality,TRM),疗效不可评估,4例未获得完全缓解(NR)。以后通过调整入组标准及回输细胞数,近期连续33例患者均获得完全缓解(CR),或达到CR但血液细胞计数未正常(CR incomplete,CRi),无1例死亡。CDl9-CAR T细胞治疗达CR后,接受异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)者80%以上持续FCM-MRD阴性至观察结束,该疗效与第1次CR期(CR1)接受移植者相同;未移植者绝大多数在CR后1年内再次复发。治疗过程中,及时稳妥地处理好细胞因子释放综合征(cytokine releasing syndrome,CRS)及各种引起复发的因素是保证治疗成功的关键。

CD19-CAR-T细胞治疗技术的产业化前景

嵌合抗原受体基因修饰T(chimeric antigen receptor gene-modified T,CAR-T)细胞治疗技术自从2010年以来在临床上不断取得突破,特别是靶向CD19分子在针对难治、复发的B细胞来源的血液肿瘤(急、慢性淋巴细胞白血病,非霍奇金淋巴瘤)的治疗上,获得了传统疗法无法达到的临床疗效,成为当下肿瘤免疫治疗中最为引人关注的领域。不过CAR-T细胞技术在治疗中不断出现的高复发率、毒副作用及CAR-T细胞高昂的制备成本都为这一技术的产业化前景带来了不确定性。本文总结了目前国际上CAR-T细胞治疗技术领军企业的发展现状,就该技术产业化发展面临的挑战进行了深入分析,并展望该产业的发展趋势和产业化前景。

CD19-CAR T在难治复发急性B淋巴细胞白血病中应用

目的:探讨CD19-CAR T(chimeric antigen receptor-modified T)细胞在难治复发急性B淋巴细胞白血病的疗效。方法:回顾性分析2015年1月至2017年7月在北京大学第三医院血液科采用CD19-CAR T细胞治疗的难治复发的急性B淋巴细胞白血病(B-ALL,B-acute lymphoblastic leukemia)患者的疗效和副作用。结果:共有10例患者被纳入本分析,均符合难治复发急性B淋巴细胞白血病的诊断,白血病细胞免疫分型均为CD19+。接受CD19-CAR T细胞治疗后28 d的总反应率(overall response rate,ORR)为70%(7/10),其中6例完全缓解(complete remission,CR)(60%),1例部分缓解(partial remission,PR)(10%); 90 d CR率为30%。结论:CD19-CAR T细胞治疗难治复发急性B淋巴细胞白血病有效,不良反应可控。

化疗药物对CD19嵌合抗原受体T细胞的体外抑制作用

目的:利用CCK8法研究不同的化疗药物对嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞的抑制作用,为临床制定化疗方案提供理论支持。方法:从正常成人外周血提取T细胞,制作成CD19-CAR-T细胞。将不同浓度化疗药物与CD19-CAR-T细胞共培养24,48,72 h和(或)96 h后,计算抑制率。结果:(1)氟达拉滨(Fludarabine,FDR)及马磷酰胺(Mafosfamide,MFA)对CD19-CAR-T细胞的抑制率随时间及浓度的增加而增加(P<0.05);(2)白舒非(Busulfan,BU)对CD19-CAR-T细胞在体外无抑制作用(P>0.05);(3)环磷酰胺(Cyclo-phosphamide,CTX)对CD19-CAR-T细胞在体外无抑制作用(P>0.05)。结论:在体外MFA及FDR对CD19-CAR-T细胞有抑制作用。CTX在体外无活性。

化疗药物诱导CD19嵌合抗原受体T细胞凋亡的信号通路

目的探讨氟达拉滨(FDR)及马磷酰胺(MFA)诱导CD19嵌合抗原受体T细胞(CD19-CAR-T)凋亡的信号通路,为研究化疗药物对CD19-CAR-T细胞抑制作用的机制奠定理论基础。方法 FDR及MFA与CD19-CART细胞相互作用后采用Annexin V/PI双染法检测CD19-CAR-T细胞膜的变化。结果经过FDR及MFA处理过的CD19-CAR-T细胞相对于未经处理过的细胞,凋亡率明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论通过细胞膜的变化可以判断FDR及MFA对CD19-CAR-T细胞具有诱导早期凋亡的作用。

2种靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞免疫疗法体内药效学研究

目的评价2种靶向CD19的嵌合抗原受体基因修饰的T(chimeric antigen receptor gene modified T,CAR-T)细胞在荷瘤免疫缺陷小鼠体内的药效,为相关产品的体内药效学评价提供参考。方法使用B-NDG小鼠构建经萤火虫荧光素酶标记的Raji细胞(Raji-Luc细胞)移植瘤模型,单次给予细胞A和细胞B(相对于细胞A,细胞B在表达CAR结构的基础上还表达IL-6沉默片段,可干扰IL-6的表达),持续观察至给药后84 d。考察小鼠存活率、临床症状、体重变化、体内Raji-Luc细胞荧光强度和组织病理学变化特点。结果细胞A和细胞B均可明显延长荷瘤小鼠生存时间,并一定程度上减缓由Raji-Luc细胞导致的体重降低,有效缓解Raji-Luc细胞负荷导致的临床表现,显著降低体内Raji-luc细胞荧光强度,明显降低Raji-Luc细胞造模动物各组织器官淋巴瘤发生率,变化呈剂量相关性。结论CAR-T治疗组动物的死因可能与肿瘤的持续性消耗及逐渐加重的背景性病变有关。细胞A和细胞B在Raji-Luc细胞荷瘤B-NDG小鼠体内呈现一定药效学作用,两者药效未见明显差异。

基于PiggyBac转座系统的CD19-CAR载体的构建及功能鉴定

目的:开发基于PiggyBac(PB)转座系统的电转染CAR-T细胞制备方法并鉴定其体外抗肿瘤功能。方法:采用健康人外周血单个核细胞(PBMC)制备T细胞,通过分子克隆技术将CD19基因克隆到PB质粒(转座子)中后经电转染法将转座子和转座酶质粒导入激活的T细胞中,并测定其转染效率,最后运用流式细胞术及荧光素酶发光实验评估其对人Burkitt’s淋巴瘤Raji细胞的杀伤能力。结果:电转染制备的CD19 CAR-T细胞转染效率较高(>60%),呈剂量依赖性,且CAR-T细胞相对于Pan-T细胞对Raji细胞杀伤能力显著(P<0.05)。结论:开发的PB转座系统的电转染方法可行,在体外对肿瘤细胞具有显著的杀伤能力,具备临床运用于CD19 CAR-T细胞制备的潜力。

CD19蛋白截短体慢病毒表达载体的构建及其在K562细胞中的表达

目的:构建胞内段缺失的CD19蛋白截短体(CD19t)慢病毒表达载体pLVX-EF1α-CD19t-IRES-Puro,并建立稳定表达CD19t的人红白血病细胞系K562/CD19t。方法:合成CD19t基因全长,酶切产物插入慢病毒载体pLVXEF1α-IRES-Puro,将重组质粒转染293FT细胞包装病毒后感染人红白血病细胞系K562,采用Western印迹和免疫荧光技术检测CD19t在K562细胞中的表达,并通过ELISA检测K562/CD19t与CD19 CAR-Jurkat共培养上清中的IL-2浓度。结果:酶切鉴定与测序结果表明成功构建慢病毒表达载体p LVX-EF1α-CD19t-IRES-Puro;Western印迹和免疫荧光检测到K562/CD19t细胞中CD19t的表达;ELISA结果显示表达的CD19t能够刺激识别CD19的CAR-Jurkat细胞分泌IL-2。结论:构建了CD19蛋白截短体慢病毒表达载体,并在K562细胞中表达,有助于进一步构建B细胞白血病动物模型和验证CAR-T效能。

自杀基因作为一种“安全性开关”控制CAR-T细胞毒性的临床前研究

目的:探讨小分子化学诱导药AP1903能否在体内外终止过表达iCasp9自杀基因的CD19靶向嵌合抗原受体修饰T(CD19CAR-T)细胞毒性功能。方法:构建过表达iCasp9的CD19CAR-T(iCasp9-CD19CAR-T)细胞并和AP1903共孵育,采用流式细胞术检测细胞表型及凋亡的方法,分别在K562和T细胞上验证iCasp9/CID自杀基因系统,在体内(观察荷Raji细胞移植瘤NCG小鼠的生存率)和体外(流式细胞术检测细胞的杀伤功能)检测AP1903给药情况下iCasp9-CD19CAR-T细胞的杀伤功能。结果:和CD19CAR-T细胞相比,iCasp9-CD19CAR-T细胞的增殖能力、表型及体内外杀伤功能均无显著差异(均P>0.05)。AP1903给药2 h后双表达i Casp9和CD19CAR的K562和T细胞分别有(33.8±0.9)%和(27.95±0.35)%的细胞出现凋亡,AP1903给药24 h后双表达iCasp9和CD19CAR的K562和T细胞均已经全部死亡。检测AP1903给药和未给药两种条件下的iCasp9-CD19CAR-T细胞体外杀伤效率,前者明显低于后者(P<0.01);iCasp9-CD19CAR-T细胞治疗荷Raji细胞移植瘤NCG小鼠,其60 d生存率同样是AP1903给药的明显低于未给药的(P<0.01)。结论:小分子化学诱导药物AP1903能在体内外有效终止iCasp9-CD19CAR-T细胞毒性功能。

抗CD19CAR-T细胞治疗难治复发B细胞肿瘤10例临床分析

目的探讨抗CD19CAR—T细胞治疗难治复发B细胞肿瘤的疗效和不良反应。方法2015年12月至2017年7月北京大学第三医院血液科收治的10例患者，包括难治复发的急性B淋巴细胞白血病（B—ALL）6例，难治复发的B细胞非霍奇金淋巴瘤（NHL）4例，采用抗CD19CAR-T细胞治疗后观察治疗效果及不良反应。结果输注后第28天进行近期疗效评估，其中6例ALL患者4例（66．7％）完全缓解（CR），1例（16．7％）部分缓解（PR）；总反应率（ORR）为83．3％。3例弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者1例达CR。1例套细胞淋巴瘤（MCL）患者大部分病灶消失，亦有顽固病灶呈进展状态。10例患者均发生细胞因子释放综合征（CRS），主要表现为发热；其中1例患者出现中枢神经系统症状，1例患者出现多脏器功能衰竭，经治疗不良反应均治愈。结论抗CD19CAR-T细胞治疗难治复发B细胞血液系统肿瘤有效，不良反应可控。

高亲和力人源化CD19 CAR-T细胞对Raji细胞株体外、体内杀伤活性研究

目的通过体内、外试验比较人源化及鼠源化CD19 CAR-T细胞对Raji细胞株的不同杀伤活性。方法收集8例拟行CD19 CAR-T治疗的淋巴瘤患者外周血,作为外周血单个核细胞(PBMC)、鼠源与人源化CD19 CAR-T细胞培养的T细胞来源。CCK-8法检测细胞增殖、LDH法检测细胞杀伤活性;BALB/c雌性裸鼠Raji荧光细胞株成瘤,活体成像技术观察裸鼠体内瘤体变化;流式细胞术检测细胞转染率及裸鼠体内CAR-T细胞比例。结果两组CAR-T细胞转染率差异无统计学意义,其增殖活性于培养24 h人源化组细胞高于鼠源组,差异无统计学意义(P=0.104),48 h人源化CAR-T细胞增殖活性明显高于鼠源组(P=0.009)。杀伤活性检测,设定不同效靶比(1∶1, 4∶1),作用24 h两种CAR-T对靶细胞的杀伤活性差异无统计学意义(P=0.102和P=0.095);48 h时不同效靶比人源化CD19 CAR-T细胞的杀伤活性高于鼠源组,差异有统计学意义(P=0.005和P=0.008),其杀伤活性均高于PBMC对照组。尾静脉注射细胞治疗Raji荷瘤裸鼠后14 d,鼠源和人源化CAR-T组裸鼠体内瘤体均缩小,对照组裸鼠瘤体增大,治疗21 d,鼠源组开始出现瘤体增大,而人源化组无明显变化。鼠源组裸鼠于25 d全部死亡,而人源化组裸鼠于31 d开始死亡。裸鼠体内CD19 CAR-T细胞检测示两组裸鼠均于输注后7 d达峰值,然人源化组细胞高于鼠源组(P4 d=0.001,P7 d=0.000,P14 d=0.003),鼠源组CAR-T细胞于21 d消失,人源化CAR-T细胞至35 d消失;生存期分析,对照组于治疗后20 d全部死亡,鼠源组裸鼠于治疗后25 d全部死亡,人源化组裸鼠于治疗后53 d全部死亡。结论人源化与鼠源CD19 CAR-T细胞相比,其增殖活性强、杀伤活性高、体内存留时间长,提示人源化CD19 CAR-T在B细胞淋巴瘤治疗的临床疗效将优于鼠源CD19 CAR-T。

CD19-CAR-T细胞的构建及其对CD19+肿瘤细胞杀伤作用

目的:利用临床B系急性淋巴细胞白血病(B-lineage acute lymphoblastic leukemia,B-ALL)患者的肿瘤细胞,建立小鼠异种移植肿瘤模型。方法:采用患者自体T淋巴细胞构建靶向CD19嵌合抗原受体T细胞(antiCD19 chimeric antigen receptor T cells,CD19-CAR-T)。利用小鼠肿瘤模型研究CD19-CAR-T细胞对CD19+肿瘤细胞杀伤作用。结果:接受患者CD34+CD19+细胞移植的NOD/SCID/IL2rγnull小鼠外周血中可以检测到大量的人源B-ALL(hu CD45+CD19+)肿瘤细胞。经过尾静脉输入CD19-CAR-T细胞,小鼠体内的B-ALL肿瘤细胞可以被完全杀灭。结论:CD19-CAR-T细胞具有显著的肿瘤杀伤能力。本研究结果对临床使用自体CD19-CAR-T细胞治疗B-ALL有积极的参考意义。

自体移植联合抗CD19 CAR-T治疗难治性弥漫大B细胞淋巴瘤的临床观察研究

目的:评估难治性弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者接受自体移植和靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞(抗CD19 CAR-T)治疗后的疗效和安全性。方法:纳入7例疾病进展的难治性ⅣB期DLBCL患者进行自体移植,自体干细胞回输后第4天回输自体共刺激因子为4-1BB的抗CD19 CAR-T细胞2.0×10^(6)/kg(1.0×10^(6)/kg~2.6×10^(6)/kg)。结果:中位随访时间186(112~326) d,最佳疗效为3例达完全缓解,4例达部分缓解,总体反应率达100%。其中巨块型的最佳疗效均为部分缓解。随访终点总生存率71.4%,其中巨块型者总生存率66%,非巨块型者总生存率75%。中性粒细胞植入时间17(14~26) d。CAR-T开始扩增的时间与中位粒细胞植入时间呈正相关(r=0.884,P=0.008)。巨块型患者中CAR-T峰值出现的时间较非巨块型者晚(r=0.864,P=0.012)。细胞因子释放综合征发生率28.6%(2/7),无严重细胞因子释放综合征发生。结论:自体移植联合抗CD19 CAR-T方案可作为难治性DLBCL拯救性治疗的方法。

定点突变优化信号肽对嵌合抗原受体T细胞功能的影响

信号肽(signal peptide, SP)参与调节嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor, CAR)结构的分泌水平及跨膜易位过程,对嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell, CAR-T)行使功能至关重要,本研究通过定点突变技术优化SP序列,并研究其对CD19-CAR-T杀伤功能的影响。首先,利用基因合成和分子克隆技术,构建含野生型SP(SP-wtY)、2种突变型SP(SP-muK或SP-muR)的靶向CD19的CAR载体;对构建成功的载体进行慢病毒包装,并使用慢病毒侵染T细胞,利用流式细胞术检测细胞的转染效率,钙黄绿素释放法检测对靶细胞的体外杀瘤能力,酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)技术检测2种细胞因子[干扰素-γ(interferon-γ, IFN-γ)和干扰素-α(interferon-α, TNF-α)]的分泌水平。结果显示,构建了野生型和信号肽突变的重组慢病毒质粒,慢病毒转导T细胞后,携带3种信号肽(SP-wtY、SP-muK或SP-muR)的CD19-CAR转染效率分别为33.9%、35.5%、36.8%。进一步杀伤实验显示,与SP-muK和SP-wtY细胞相比,SP-muR细胞的肿瘤杀伤效果显著提高,当效靶比为10:1时共培养24 h后,SP-muR组CAR-T细胞的细胞因子IFN-γ和TNF-α分泌水平显著高于SP-muK和SP-wtY组。本研究揭示信号肽N端正电荷数的增加可以提高CAR的表达效率和对CD19+靶细胞的杀伤作用,为CAR结构的优化改造和临床高效应用提供了科学依据。