CAR-T细胞治疗老年急性B淋巴细胞白血病的临床研究

目的 探讨CAR-T细胞疗法治疗老年急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)患者的安全性和有效性。方法 回顾性分析2020年5月—2022年12月苏州大学附属第一医院收治的接受CAR-T治疗的21例老年急性B淋巴细胞白血病患者的临床及随访资料,探讨CAR-T的有效性及安全性。结果 21例老年B-ALL患者CAR-T治疗后细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome,CRS),中性粒细胞减少症和中性粒细胞缺乏症发生率分别为:38.1%(8/21),42.9%(9/21)和28.6%(6/21);与CAR-T回输前相比,CAR-T后一周白细胞绝对计数无显著差异,一个月后显著升高(P<0.001),中性粒细胞计数在CAR-T后一周和一个月均无显著差异(P>0.05),C反应蛋白在CAR-T后7天显著升高,30天后显著降低(-3 d vs 7 d,P=0.007;30 d vs 7 d,P=0.000 6);首次输注CAR-T后完全缓解率(complete remission,CR)为85.7%(18/21),中位随访时间为17个月;CAR-T后无进展生存率(progression-free survival,PFS)为81.0%,与性别、CAR-T细胞类型、费城染色体、高肿瘤负荷、桥接造血干细胞移植(HSCT)、治疗次数、LDH值以及血小板计数均无相关性(P>0.05),中位PFS为13个月;R/R B-ALL患者CAR-T治疗后CR率为75%(6/8),PFS率为67.5%,中位PFS时间为12个月;回输CAR-T后复发时间平均为10.2个月。结论 CAR-T细胞疗法用于治疗老年B-ALL患者具有较好的缓解率,为预后差的老年B-ALL患者提供有潜能的治疗手段。

靶向HER2的通用型CAR-T细胞来源的细胞外囊泡的制备及功能鉴定

目的 利用可持续传代的T淋巴细胞系,制备携带靶向人表皮生长因子受体2(HER2)蛋白的嵌合抗原受体(CAR)的细胞外囊泡(EV),并检测其对HER2^(+)肿瘤细胞的杀伤能力。方法 采用分子克隆技术构建重组慢病毒质粒。利用成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)技术和慢病毒感染的方法构建底盘Jurkat细胞。流式细胞术检测底盘Jurkat细胞、嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞和CAR-Jurkat细胞的构建。通过聚乙二醇6000(PEG6000)浓缩方法和细胞挤压方法制备EV;微粒子追踪分析(NTA)和Western blot法鉴定EV。萤光素酶报告基因系统检测细胞和EV对肿瘤细胞的杀伤作用。荧光显微镜观察免疫细胞对EV的吞噬作用。结果 酶切鉴定和基因测序结果表明重组质粒构建成功。流式细胞术结果显示底盘Jurkat细胞、 CAR-T细胞和CAR-Jurkat细胞顺利制备。NTA结果显示制备的EV大小正确。萤光素酶报告基因系统证明CAR-T细胞、 CAR-Jurkat细胞、 CAR-T EV和CAR-Jurkat EV对HER2+肿瘤细胞均具有靶向杀伤能力。荧光显微镜观察表明,提高CD47分子的表达水平能够减弱免疫细胞对通用型CAR-Jurkat EV的吞噬作用。结论 通用型CAR-T细胞来源EV能够靶向杀伤HER2+肿瘤细胞。

通过CRISPR/Cas9敲除PD-1有效增强EGFR-CAR-T细胞对肺癌的抗肿瘤活性

目的探索基于规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR关联蛋白质(Cas)9敲除程序性死亡受体(PD)-1的靶向表皮生长因子受体(EGFR)的嵌合抗原受体(CAR)-T细胞是否可以有效抑制肺癌的进展。方法通过慢病毒感染获得CAR-T细胞,并通过电转引导RNA(gRNA)及Cas9蛋白敲除PD-1;流式细胞术检测CAR-T细胞阳性率、肿瘤细胞表面EGFR表达、与靶细胞共孵育后CAR-T细胞中PD-1表达及肿瘤浸润T细胞的比例;乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测CAR-T细胞对靶细胞的细胞毒性;免疫缺陷鼠移植瘤模型检测体内抑瘤能力;免疫组化法检测肿瘤组织中PD-1表达;结果CAR-T细胞的阳性率均超过40%;肿瘤细胞中NCI-H23及A549高表达EGFR,NCI-H1650低表达EGFR,HCC827不表达EGFR;CAR-T及PD-1-CAR-T细胞均可以以抗原依赖的方式杀伤肿瘤细胞,且PD-1-CAR-T细胞的杀伤活性较CAR-T细胞更强(P<0.05);此外,PD-1-CAR-T细胞与靶细胞共孵育后PD-1细胞比例更低(P<0.01);PD-1-CAR-T细胞的体内抑瘤能力更强,且可以更显著地延长小鼠生存期;PD-1-CAR-T细胞在肿瘤中的增殖水平更高(P<0.001),且PD-1-CAR-T组肿瘤中PD-1细胞数更低(P<0.001)。结论CRISPR/Cas9介导的PD-1敲除可以在体外和体内改善CAR-T细胞的效应功能,增强其对肺癌的抑制活性。

儿童白血病CAR-T细胞疗法的研究进展

儿童白血病是儿童血液系统最常见的恶性肿瘤,严重影响儿童的健康。随着社会发展及环境改变等因素,儿童白血病患者呈逐年上升趋势,临床常采取化疗为主的方式治疗,尽管其治疗已获得了长足进步,但是部分患儿因伴随严重器质性疾病不能耐受化疗或化疗后出现复发,甚至死亡。嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T-cell,CAR-T)疗法属于一种最热门的免疫细胞疗法,通过体外基因工程技术修饰重组和转染患者T细胞,再回输给患者达到识别肿瘤细胞、靶向杀伤的目的。本文对儿童白血病(chimeric antigen receptor T-cell,CAR-T)细胞疗法的研究进展进行如下综述,为进一步临床研究奠定基础。

CD4^(+)CAR-T细胞亚群在肿瘤治疗中作用的研究进展

嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞疗法是目前治疗癌症最有效的一种免疫治疗方法,但CAR-T细胞功能障碍很大程度限制其自身对癌症治疗的效果。T细胞功能的差异以及记忆和效应T细胞的作用被证明在CAR-T细胞治疗中极为重要。CD8^(+)T细胞作为发挥抗癌作用的主要效应细胞一直是研究焦点,而对CD4^(+)T细胞的关注较少。CD4^(+)T细胞不仅可以通过激活CD8^(+)T细胞使其杀伤肿瘤细胞,还可以独立发挥抗肿瘤作用。现有研究发现,细胞因子、共刺激域和细胞代谢等因素均可影响CD4^(+)CAR-T细胞亚群的增殖和分化。本文主要综述了CD4^(+)CAR-T细胞亚群在治疗肿瘤中的重要性以及影响其增殖分化因素的研究进展,为进一步研发高效的CAR-T细胞提供新思路。

IL-12-CAR-T细胞诱发细胞因子释放综合征小鼠模型的建立及观察

目的:通过构建表达IL-12的小鼠CAR-T细胞,探讨经尾静脉将其输注于小鼠体内建立细胞因子释放综合征(CRS模型的方法。方法:构建基于靶向鼠源CD19的CAR分子,包装逆转录病毒载体并感染小鼠T细胞构建mCD19-CAR-T、mCD19/IL-12-CAR-T细胞。通过构建小鼠体内胰腺癌Panc02-CD19细胞移植瘤模型,检测mCD19/IL-12-CAR-T细胞的抗肿瘤活性,ELISA法检测两种CAR-T细胞IL-12和IFN-γ分泌水平;经小鼠尾静脉输注mCD19/IL-12-CAR-T细胞构建CAR-T细胞CRS小鼠模型,流式细胞术检测小鼠血清中IL-6、MCP-1、IL-1、IL-10、TNF-α、IFN-γ等细胞因子的含量,H-E染色法观察荷瘤小鼠肝、脾、肺和肾的病理组织学变化。结果:经过培养扩增的mCD19/IL-12-CAR-T细胞能有效分泌IL-12,CAR阳性率达(56.9±5.4)%;与非靶细胞Panc02或靶细胞Panc02-CD19共培养时,均能高分泌IFN-γ。成功构建小鼠胰腺癌Panc02-CD19细胞移植瘤模型,经小鼠尾静脉注射1×10^(6)个mCD19/IL-12-CAR-T细胞能显著抑制移植瘤的生长,但未能诱发严重CRS;输注2×10^(6)个mCD19/IL-12-CAR-T细胞后,小鼠出现体质量减轻、血清炎性因子水平升高、组织损伤,最终导致死亡等一系列典型CRS表现。结论:成功构建IL-12-CAR-T细胞诱发的小鼠CRS模型,其稳定性好、重复性高,具有广泛的应用前景。

应用CAR-T细胞治疗T淋巴细胞肿瘤的最新研究进展

T淋巴细胞肿瘤是一组包含多种类型的淋巴系统肿瘤的疾病,异质性强,临床转归差。嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法作为一种新的免疫细胞治疗方式,在B淋巴细胞肿瘤领域取得了突破性进展,据此,人们对这项技术在T淋巴细胞肿瘤领域的应用前景也产生了浓厚的兴趣。研究表明,CAR-T细胞治疗T淋巴细胞肿瘤已经取得了一定进展,针对某些靶点的CAR-T已经进入临床试验阶段。但是由于T细胞本身的特性,目前也存在很多挑战。本文对于应用CAR-T细胞治疗T淋巴细胞肿瘤的最新研究进展作一综述。

基于合成生物学的CAR-T细胞治疗实体肿瘤的研究进展

合成生物学借助工程化技术在人工生物系统的设计与构建方面已经取得了长足进展,尤其在CAR-T细胞的开发和应用中为实体肿瘤治疗带来了深刻变革。在合成生物学技术的支持下,新一代的CAR-T细胞可以在靶向肿瘤后激活细胞因子释放通路,实现CAR-T细胞在肿瘤部位的自我调节;工程化的T细胞在CAR的基础上也可以表达其他受体元件(如正交型IL-2、IL-9受体等),通过人工给药干预可在体内实现多功效、特异性刺激,这对于实现CAR-T细胞在体内的精准刺激和克服抑制性肿瘤微环境等意义非凡。此外,智能化CAR回路系统如synNotch基因回路系统和CAR开关系统等研究结果表明,CAR-T细胞可以通过自身基因回路的反馈或人工给药干预来发挥或终止杀伤功能,可有效保证CAR-T细胞在治疗过程中的安全性。虽然针对实体肿瘤靶点难题的CAR-T细胞开发目前尚未有突破性进展,但对于有明确靶点的肿瘤,Ⅰ期临床试验结果已经显示CAR-T细胞治疗实体肿瘤具有巨大潜力。因此,明确当下CAR-T细胞治疗实体肿瘤的作用机制和应用现状,可以对后续开发高效低毒CAR-T细胞提供新思路。

CD19CAR-T细胞治疗难治复发性急性B-ALL的研究进展

近年来,难治性和复发性急性白血病生存率低、预后差,其治疗成为国内外一大难题,随着免疫治疗的问世,多项临床研究结果显示嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)在复发难治性急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)的效果显著,CAR-T细胞治疗被认为是最具有潜力的新型免疫疗法,然而,也出现一系列并发症,严重限制了CD19CAR-T细胞的临床应用。本文综述了近年来CD19 CAR-T细胞治疗B-ALL的临床研究进展、一系列并发症及改进策略。

血液肿瘤患者car-t细胞治疗全程管理实施及效果

探讨血液肿瘤病患car-t细胞治疗全程管理实施效果。方法 选取昆明医科大学第三附属医院·云南省肿瘤医院84例病患,随机归入CGGL组与QCGL组各42例,CGGL组实施常规管理,QCGL组实施全程管理,对比2组负性情绪(SAS得分值、SDS得分值)、并发症(细胞因子释放综合征 、肿瘤溶解综合征)、生活质量、护理好评率。结果 QCGL组护理后的SAS得分值、SDS得分值低于CGGL组,P<0.05。QCGL组的并发症发生率低于CGGL组,P<0.05。QCGL组护理后的QLQ-C30得分值高于CGGL组,P<0.05。QCGL组的护理好评率高于CGGL组,P<0.05。结论 全程管理可确保血液肿瘤病患car-t细胞治疗的顺利实施,能有效缓解病患负性情绪,增加治疗安全性,减少并发症发生,并提升其生活质量,可采纳与运用。

具有中央记忆T细胞表型的新型CAR-T细胞的制备及其对GD2阳性人骨肉瘤细胞的杀伤作用

目的通过优化嵌合抗原受体结构制备具有中央记忆T细胞表型并靶向双唾液酸神经节苷脂(GD2)的新型嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞,检测其对GD2阳性骨肉瘤细胞的杀伤能力。方法构建由抗GD2单链抗体、CD28铰链区及跨膜序列、4-1BB胞内共刺激域和CD3ζ胞内段组成的新型嵌合抗原受体慢病毒载体,包装纯化慢病毒并感染Jurkat细胞,检测所得新型CAR-T细胞的感染效率、扩增能力、记忆表型以及不同骨肉瘤细胞株的GD2表达水平;慢病毒感染并筛选稳定表达荧光素酶和增强型红色荧光蛋白(eRFP)的GD2+MG63细胞系;荧光素酶实验检测新型CAR-T细胞对建系MG63细胞的杀伤能力。结果获得优化结构的新型CAR-T细胞,CAR阳性率达到92%以上;新型CAR-T细胞具有良好的体外扩增能力和中央记忆T细胞表型;杀伤实验显示新型CAR-T细胞能够有效杀伤GD2阳性的MG63骨肉瘤细胞。结论通过优化CAR分子结构成功制备的新型CAR-T细胞具有中央记忆T细胞表型,能够有效杀伤GD2阳性骨肉瘤细胞。

CAR-T细胞临床试验治疗血液系统肿瘤患者心理体验的质性研究

目的探讨CAR-T细胞临床试验治疗血液系统肿瘤患者在临床试验期间的真实心理体验,为临床护理人员对患者进行心理支持提供借鉴。方法采用质性描述的方法,对8例受试者进行深入访谈、现场录音和笔录,使用Colaizzi分析程序进行分析、整理,提炼主题。结果 CAR-T临床试验治疗血液系统肿瘤患者的心理体验归纳为4个主题:希望与期待、担心严重的并发症的发生、信息需求、缓解了沉重的经济压力。结论 CAR-T临床试验治疗患者需要深切的人文关怀和情感支持,护理人员应采取个性化的护理措施,满足受试者心理需求的特殊性问题,形成完整的、有针对性的护理体系,提高CAR-T临床试验的护理水平。

CAR-T细胞免疫疗法临床研究与伦理审查实践

目的探讨与分析CAR-T细胞免疫疗法临床研究的特点及伦理审查要点,为在目前阶段及现行法规下促进国内细胞类产品临床研究规范开展,保障受试者安全与权益提供参考。方法国内CAR-T细胞免疫疗法临床研究发展迅猛,但对风险认知尚不充分,结合CAR-T细胞免疫疗法临床研究的发展,国内外细胞治疗临床研究的相关监管制度以及所在中心临床研究伦理审查的实践与案例进行分析与论述。结果CAR-T细胞免疫疗法仍属于前沿技术,目前开展的临床研究对其技术标准、临床疗效与潜在风险的认知与评估处在不断地发展与经验积累的过程,伦理审查应充分了解新技术的发展,结合国家卫生行政部门相关法规,提高对研究风险的辨识能力,合理评估研究的风险与受益比,从多角度确保受试者的安全与权益得到充分考量与讨论,为细胞治疗临床研究的规范开展,受试者的安全保驾护航。结论借助加入ICH-GCP的契机及发达国家和地区的监管经验,伦理委员会不断加强自身的学习,提升认知与审查能力,依法、科学监管,有助于推进CAR-T产品及细胞治疗技术临床研究在国内健康发展,尽快安全、有效地惠及更多的肿瘤患者。

CAR-T细胞治疗产品中复制型病毒的风险分析及控制

嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)因其在血液肿瘤中的显著疗效已成为肿瘤免疫治疗领域中的国际研究新热点,成为肿瘤治愈新的希望。目前,在CAR-T细胞产品的生产中,通常是利用逆转录病毒载体或慢病毒载体将CAR基因高效地导入T细胞中,但在使用这些病毒载体的同时也带来了CAR-T产品污染复制型逆转录病毒(RCR)或复制型慢病毒(RCL)的潜在风险。虽然随着病毒载体设计及生产体系的不断改进,这种风险已大大降低,但仍不能完全排除。因此,监管机构要求对于临床使用的慢病毒或逆转录病毒载体、转导的CAR-T细胞产品以及患者均要进行复制型病毒的检测。本文主要通过分析复制型病毒污染检测的必要性、降低复制型病毒污染风险的措施、复制型病毒检测的阶段以及检测方法等方面,提出在CAR-T细胞生产过程中控制RCR/RCL的策略,以供CAR-T细胞产品研发者参考。

CAR-T细胞治疗儿童复发性B系急性淋巴细胞白血病所致细胞因子释放综合征临床分析

目的探讨CAR-T细胞疗法治疗儿童复发性B系急性淋巴细胞白血病(B-ALL)时出现的细胞因子释放综合征(CRS)的临床特征。方法回顾分析2019年1月至2020年6月收治的14例CAR-T细胞治疗的复发性B-ALL患儿的临床资料。结果14例复发性B-ALL输注CAR-T细胞后,9例发生严重CRS,11例患儿出现血流动力学不稳,5例需要机械通气,10例有神经系统症状,7例出现肝损害。14例患儿均使用托珠单抗治疗,7例静脉使用糖皮质激素,5例行血液净化治疗。3例患儿死亡,11例在2周内好转。结论CRS是CAR-T细胞输注后的常见毒性反应,可出现多器官功能障碍,CRS的严重程度与细胞因子IL-6、IFN-γ水平呈正相关。托珠单抗和激素是最主要的治疗方法,血液净化也是CRS的一种特殊治疗方法。

CD3ζ链引入YRHQ基序可增强靶向HER2的CAR-T细胞的抗肿瘤活性

目的:探讨在靶向HER2的CAR的CD3ζ链胞内区引入YRHQ基序对CAR-T细胞的特异性杀伤活性及免疫记忆形成的影响。方法:通过DNA合成获得包含靶向HER2的编码抗原受体H28ζ或H28ζ(YRHQ)的DNA片段,通过慢病毒载体将不同CAR的DNA片段分别转导健康人外周血T细胞,制备靶向HER2的H28ζ-CAR-T及H28ζ(YRHQ)-CAR-T细胞。扩增过程中对不同CAR-T细胞进行计数,FCM检测CAR的表达率。将CAR-T细胞分别与HER2阳性的SKOV3、MDA-MB-453或HER2阴性的MCF-7细胞共培养,LDH释放法检测其杀伤活性,ELISA法检测IL-2、IFN-γ和颗粒酶B的水平,WB法检测STAT3磷酸化水平及免疫检查点分子TIM-3和PD-1的表达,通过FCM检测CCR7、CD45RO的表达,分析CAR-T细胞的表型。结果:H28ζ-CAR-T和H28ζ(YRHQ)-CAR-T细胞扩增能力较好,体外培养7 d时扩增4~5倍。H28ζ-CAR和H28ζ(YRHQ)-CAR表达率分别为(33.3±2.85)%和(28.30±3.2)%。H28ξ(YRHQ)-CAR-T细胞的杀伤活性较H28ζ-CAR-T细胞更高(P<0.05)。经HER2抗原刺激后,与T细胞或H28z-CAR-T细胞比较,H28ξ(YRHQ)-CAR-T细胞的STAT3磷酸化水平较H28ξ-CAR-T细胞明显升高(P<0.01);而两者间PD-1和TIM-3的表达无明显差异。未经抗原刺激的CAR-T细胞CCR7和CD45RO表达与正常T细胞比较差异无统计学意义(均P>0.05),与SKOV3细胞共培养后,与T细胞或H28z-CAR-T细胞比较,H28ξ(YRHQ)-CAR-T细胞中T_(EM)细胞比例明显增加、T_(CM)细胞比例明显减少(均P<0.05)。结论:在CD3胞内区引入YRHQ基序可在一定程度上提高CAR-T细胞的杀伤潜力。

CD19和CD22双靶点CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用

目的:设计并制备一种分别靶向B细胞表面抗原CD19和CD22的CAR-T细胞,检测其对肿瘤细胞的体内外杀伤效果。方法:将含有人源化CD19 Sc Fv的二代CAR分子和带有CD3ε链作为共刺激结构域的CD22 Sc Fv CAR分子以P2A自剪切肽连接,序列连接于慢病毒载体p LTR-CMV-MCS中,以HEK-293T细胞包装相应的慢病毒载体,感染健康志愿者提供的T细胞制备CAR-19-22-T细胞,同时以相同二代结构分别构建单靶向CAR-T细胞作为参照。构建表达荧光素酶、CD19和/或CD22的前列腺癌3M细胞(靶细胞)。将各种CAR-T细胞与靶细胞共同培养,采用荧光素酶化学发光法和ELISA法检测其对靶细胞的杀伤能力和细胞因子的分泌水平。通过尾静脉注射Raji-Luc细胞构建NOD-SCID免疫缺陷小鼠白血病模型,分别注射各组CAR-T细胞进行治疗并评估其疗效。结果:培养7 d的CAR-19-22-T细胞的CAR-19表达率为13.7%,CAR-22表达率为14.3%。CAR-19-22-T细胞在10∶1效靶比时,对3M-CD19-Luc、3M-CD22-Luc和3M-CD19-CD22-Luc细胞的杀伤率均显著高于T细胞[(78.1±14.4)%vs(11.1±4.3)%(、46.7±10.7)%vs(12.4±2.7)%(、90.5±4.3)%vs(14.3±3.7)%,均P<0.01];与3M-CD19-Luc、3M-CD22-Luc、3M-CD19-CD22-Luc靶细胞共培养后,CAR-19-22-T细胞IFN-γ、TNF-α和IL-2水平均显著低于CAR-19-T和CAR-22-T细胞(P<0.05或P<0.01)。CAR-19-22-T细胞对移植Raji-Luc细胞模型小鼠治疗效果明显,其生存期显著长于T细胞组(P<0.01),与CAR-19-T组和CAR-22-T组荷瘤小鼠比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论:成功设计并制备了一种双靶点CAR-19-22-T细胞,其能够有效杀伤表达CD19和/或CD22抗原的肿瘤细胞,对Raji-Luc细胞的白血病模型小鼠有显著的治疗效果。

CAR-T细胞治疗实体瘤的现状研究

肿瘤免疫治疗是指利用人体的免疫机制,通过主动或被动的方法增强患者免疫功能,达到杀伤肿瘤细胞的目的。嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)作为肿瘤免疫治疗的新型精准靶向疗法,近几年通过优化和改良已成功应用于多种血液肿瘤的治疗,是目前恶性肿瘤治疗中最有潜力的疗法之一。但由于实体瘤中存在显著的异质性和复杂的肿瘤免疫微环境,CAR-T在实体瘤中的应用仍面临诸多挑战。本文将对目前CAR-T细胞治疗实体瘤的研究成果、现存挑战及相应的优化策略进行综述,以期为后续CAR-T细胞治疗实体肿瘤研究提供参考。

CAR-T细胞技术研究进展及发展趋势

由于存在肿瘤异质性和免疫抑制微环境等因素,CAR-T细胞治疗实体瘤还未显示出明显的临床疗效。针对实体瘤治疗,近年在CAR-T细胞制备方面已有较大进展。本文就近年来在实体瘤治疗方面CAR-T细胞技术的研究进展和未来发展趋势进行评述。

CAR-T细胞采集术的护理

总结了CAR-T细胞采集的全程护理方法,主要护理措施包括采前的科普宣教、环境准备、饮食及睡眠护理;采集过程中的生理和心理支持、建立良好血管通道、预防并及时处理各种不良反应等;采集后的防护、饮食、沟通等。认为正确的护理可以顺利并高质量地完成对CAR-T细胞的采集。