龟甲配方颗粒的高分辨熔解曲线技术鉴别研究

目的建立一种龟甲配方颗粒高分辨熔解曲线(HRM)技术鉴别方法。方法根据乌龟Chinemys reevesii及其混伪品的细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome oxidase subunitⅠ,COI)基因序列上的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)位点设计鉴别引物,扩增产物直接进行HRM分析,并优化反应体系,根据最佳条件进行适用性验证。结果在模板DNA质量浓度为0.62~374.88 ng/μL、引物浓度为0.1~0.4μmol/L、退火温度为62℃、循环数为45个的条件下,龟甲饮片和配方颗粒的熔解曲线为单峰,其Tm均值分别为(82.39±0.09)、(82.38±0.05)℃,而混伪品和醋龟甲配方颗粒未有扩增。结论该研究建立的高分辨熔解曲线鉴别方法可快速鉴别龟甲原料和配方颗粒的真伪,以及区分其生品和炮制品配方颗粒,为龟甲配方颗粒的质量标准研究提供了理论依据。

超高效液相色谱-质谱法鉴别蛤蚧定喘丸中的龟鳖甲类成分

目的建立蛤蚧定喘丸中龟鳖类成分的检测方法。方法借鉴动物类药材特征肽鉴别方法,采用胰蛋白酶对不同批次的蛤蚧定喘丸样品进行酶解,利用超高效液相色谱-质谱(UPLC-MS/MS)法,选择龟鳖类特征分子离子峰作为检测离子对,ESI+模式,进行多反应监测模式检测。结果8家生产企业共51批蛤蚧定喘丸样品中均检出鳖甲成分,未检出其他龟鳖源成分。结论该方法专属性较好,可用于蛤蚧定喘丸中龟鳖类成分掺伪检测。

龟甲炮制工艺研究

目的:探索龟甲最优炮制工艺。方法:以18种氨基酸总含量和总多酚含量为评价指标,采用L_(9)(3^(4))正交试验优化转速、砂烫温度、砂烫时间,并进行验证实验。结果:在转速为20 r·min^(-1)、砂烫温度为240℃、砂烫时间为2 min条件下炮制龟甲,炮制品质地酥脆、总氨基酸和总多酚溶出度较高,3批炮制品的氨基酸平均总质量分数和总多酚平均质量分数分别为19.67%、50.74 mg·kg^(-1)(RSD分别为1.06%、0.87%)。结论:优化的龟甲炮制工艺稳定可行,可为龟甲工业化生产工艺研究提供参考。

龟板对局灶性脑缺血后神经干细胞的作用

【目的】探讨补肾中药龟板对局灶性脑缺血后神经干细胞的作用。【方法】采用大脑中动脉线栓法造成局灶性脑缺血大鼠模型 ,应用免疫组织化学技术检测神经上皮干细胞蛋白 (Nestin)的表达 ,观察龟板对脑缺血后神经上皮干细胞蛋白的影响。【结果】龟板可降低神经病评分和增强脑缺血后Nestin表达。【结论】提示补肾中药龟板可减轻神经损伤症状和对局灶性脑缺血后神经干细胞有促进增殖作用。

龟板含药血清对大鼠骨髓间质干细胞体外增殖的影响

[目的]观察益肾中药龟板血清对大鼠骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)体外增殖的影响。[方法]使用密度梯度法分离大鼠骨髓间质干细胞进行培养,经5-溴脱氧尿嘧啶(Brdu)标记和CD44染色及两者双重染色鉴定后,分别从光学显微镜下的形态学特征、免疫细胞化学染色后的MSC表型特征、四甲基偶氯唑盐(MTT)染色后MSC的吸光值以及以Brdu、增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组化染色后MSC的阳性细胞数变化等角度观察在培养液中添加不同浓度龟板血清条件下MSC的生长变化。[结果]不同浓度的龟板血清均以浓度依赖方式促进MSC增殖活力和增加Brdu、PCNA阳性细胞数,与对照组比较具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。[结论]龟板血清可促进MSC的增殖而有利于细胞脱氧核糖核酸(DNA)合成,推测这可能是龟板补肾的机理之一。

龟板含药血清体外诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元

[目的]观察龟板含药血清体外诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元的能力。[方法]采用龟板含药血清体外定向诱导第五代骨髓间充质干细胞,免疫组化鉴定神经丝蛋白(NFP)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。[结果]成年大鼠骨髓间充质干细胞受龟板血清诱导后神经元样细胞NF表达阳性,诱导后12 h,神经元样细胞NF阳性表达达到高峰。[结论]龟板含药血清可以在体外诱导成年大鼠骨髓间充质分化为神经元。

龟甲提取物对骨髓间充质干细胞增殖过程中核受体的影响

【目的】观察龟甲(也称龟版或龟板)提取物对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)增殖过程中核受体 (nuclear receptor,NR)表达的影响。【方法】采用密度梯度法分离大鼠MSC进行培养,经5-溴脱氧尿嘧啶(Brdu)标记和 CD44免疫组化染色鉴定后,分别以高、中、低剂量的龟甲提取物(3 333、333．3、33．33μg／mL)加入到体外培养的MSC中, 与龟甲提取物作用12、24、72、120 h后,采用免疫组化法和免疫荧光细胞化学法检测MSC的视黄酸受体(retinoic acid receptor-α,RARα)、维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)、雌激素受体(estrogen reeepror,ER)、糖皮质激素受体 (glucocorticoid receptor,GR)、甲状腺激素受体(thyroid hormone receptor-α,TRα)和过氧化物酶体增殖物活化受体(peroxisome proliferator activated receptor-δ,PPARδ)的表达。【结果】高、中、低剂量龟甲提取物组的MSC的RARα、VDR表达阳性细胞均高于对照组(P<0．05或P<0．01),且呈剂量依赖性;作用24 h后RARα表达达峰值,作用72 h后VDR表达达峰值。未检测到ER、GR、PPARδ、TRα阳性反应细胞。【结论】视黄酸受体α和维生素D受体可能为龟甲提取物促MSC增殖的药理靶点。

龟板对大鼠局灶性脑缺血模型3种NOS亚型的作用

目的探讨补肾中药龟板对局灶性脑缺血后脑组织3种NOS亚型的作用。方法采用大脑中动脉线栓法造成大鼠局灶性脑缺血模型,应用免疫组织化学技术检测脑组织3种亚型NOS(nNOS、iNOS、eNOS)的表达,观察龟板对脑缺血后3种亚型NOS的作用。结果龟板组缺血侧皮层和尾壳核nNOS、iNOS表达显著低于模型对照组(P<0.01),而eNOS表达显著高于模型对照组(P<0.01)。结论中药龟板能部分下调脑缺血所致nNOS、iNOS的异常表达,上调eNOS表达,这可能是其治疗缺血性脑血管疾病的机理之一。

甘凉与甘温归肝肾经中药对雌二醇致小鼠肾阳虚的影响

目的观察比较甘凉归肝肾经(女贞子、龟甲)与甘温归肝肾经(海马、菟丝子)中药对雌二醇致小鼠肾阳虚的影响。方法ICR雄性小鼠,随机分为正常对照组、模型对照组、金匮肾气丸组、女贞子组、龟甲组、海马组、菟丝子组。采用腹腔注射苯甲酸雌二醇造成小鼠肾阳虚模型。灌胃给药,连续12d,每日1次。期间观察小鼠体征,测量小鼠肛温、抓力、自主活动;末次给药后取血,测血清TP、ALB、TC、TG、ALT、AST等生化指标;取肝、肾、睾丸、精囊腺,测定脏器指数。结果女贞子、龟甲能增加肾阳虚小鼠自主活动,升高血清TP、ALB水平,其中女贞子还能增加抓力,减少肝脏指数,升高血清TC、TG水平。海马、菟丝子能升高肾阳虚小鼠的肛温,增加抓力和自主活动,增加精囊腺指数,降低血清ALT、AST水平,减少肝脏指数,其中海马还能增加肾脏指数,菟丝子还能增加睾丸指数。结论四味中药均通过甘入肝肾而表现出改善腰膝酸软、精神萎靡的作用,但在改善畏寒肢冷、性欲减退、肝功能损害等方面有一定差异。说明性味归经相同的中药可表现出相近或相同的药理作用;甘温、甘凉归肝肾经中药虽然味甘、作用部位在肝肾经,但因药性不同,药理作用仍有较大差异,故在"性味结合归经"层面探讨中药功效的共同规律可能更有意义。

中药龟甲HPLC指纹图谱研究

目的:建立中药龟甲的HPLC指纹图谱,以达到鉴别龟甲与其混伪品的目的。方法:收集不同产地的龟甲及其混伪品21批,按上下甲进行分类,共42个样品。通过盐酸水解、脱磷、脱钙等前处理,以6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基-氨基甲酸酯(AQC)进行衍生化反应,采用C18色谱柱(3. 9 mm×150 mm,3μm),柱温37℃,以乙腈,水,缓冲盐为流动相进行梯度洗脱,流速1. 00 m L/min,检测波长248 nm。采用"中药指纹图谱相似度评价系统"(《中华人民共和国药典》2012版)对正品龟甲上甲与下甲、正品与常见混伪品进行相似度分析。结果:所建立的指纹图谱具有较好的精密度、重现性和稳定性。正品龟甲的上下甲相似度为0. 932～0. 995。正品与混伪品的相似度在0. 90以下者占90. 91%。结论:正品上、下甲的HPLC图谱差异较小,正品与混伪品差异较明显。所建立的HPLC指纹图谱可用于龟甲的质量评价。

超细粉碎对龟甲水溶性蛋白质溶出度及煎出率的影响

目的考察超细粉碎对龟板水溶性蛋白质溶出度及煎出率的影响。方法采用传统粉碎方法(通过100目筛,细粉)及超细粉碎方法(通过300目筛,超细粉)比较龟板水溶性蛋白质溶出度,并用正交试验设计研究影响龟板煎出率的工艺条件。结果细粉水溶性蛋白质几乎不溶出,而超细粉20min溶出度达51.2%,2h达70.5%。正交试验考察了细度、煎煮次数、煎煮时间3个影响因素,方差分析结果表明细度显著影响煎出率(P<0.05),而后两者影响不显著(P>0.05)。结论超细粉碎有利于提高龟板水溶性蛋白质的溶出度及煎出率。

鳖甲、龟板中脂肪酸的GC-MS比较分析

目的:采用GC-MS测定法分别对龟板和鳖甲中的脂肪酸进行比较分析。方法:分别对龟板和鳖甲提取的甲酯化样品进行GC-MS分析,质谱图用NISTO5s.LIB和NISTO5.LIB谱图检索,鉴定各种脂肪酸,并用色谱峰面积归一化法测定其相对百分含量。结果:发现龟板中含有13种脂肪酸,其中不饱和脂肪酸占70.21%。鳖甲中含有13种脂肪酸,其中不饱和脂肪酸占58.67%。结论:该方法检测脂肪酸简便快速,灵敏度高。

龟甲的研究进展

介绍了龟甲近13年来在鉴别、活性成分及药理方面的研究进展,建议今后龟甲的研究利用现代分子生物技术,建立一个快速准确鉴别龟甲的方法,结合中医辨证论治理论和现代先进的科技手段,发现龟甲的活性成分及其调控机制,从而能为龟甲的质量控制提供理论和实验依据,才能进一步开发出龟甲的巨大药用价值。

龟甲的特异性PCR及高分辨率熔解曲线技术鉴别方法研究

目的:建立高效、稳定的龟甲Testudinis Carapax et Plastrum DNA鉴别方法。方法:利用龟甲的特异性聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)鉴别方法和高分辨率熔解曲线(HRM)鉴别方法,根据龟甲及其混伪品COI序列差异,寻找特异性单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点设计鉴别引物,并对PCR反应条件进行优化;并使用通用引物扩增COI区域,产物直接进行HRM分析。结果:当退火温度为60 ℃,循环次数为35,使用设计的龟甲特异性鉴别引物GJ-360.F/R进行PCR扩增,经扩增均获得约360 bp特异性鉴别条带,混伪品皆无条带;使用通用引物RonM-tl和Vl-tl进行PCR扩增,产物使用HRM分析,龟甲药材在模板DNA质量浓度为3.5~87.9 ng ·μL^-1 、引物浓度为0.2 μmol · L ^-1 、镁离子浓度为2.0 mmol · L ^-1 的条件下,龟甲药材标准熔解曲线为双峰,其 T m均值分别为(83.15±0.76)、(87.53±0.69 )℃。结论:特异性PCR和HRM均可作为一种快速准确鉴别龟甲正伪品的鉴定方法。

中药材龟甲细胞色素b基因特异性鉴定研究

目的建立一种实用、简便、准确的中药材龟甲DNA分子标记鉴定方法。方法采用酚-三氯甲烷抽提法和盐析法提取龟甲mtDNA。从GenBank数据库中下载乌龟及常见伪品源动物mtDNA细胞色素b基因序列,经序列比较分析,设计特异性引物,并使用该引物对正品及其伪品mtDNA进行扩增并测序。结果盐析法提取DNA的浓度高于酚-三氯甲烷抽提法,并且盐析法省时、经济。本实验所设计引物只能扩增正品龟甲mtDNA,测序结果与龟甲同源性100%。结论盐析法是一套适合从龟甲中提取高质量DNA的方法,本实验所设计的引物具有高度特异性,可用于龟甲类药材的鉴定。

龟板改善激素性骨质疏松大鼠骨量、骨微细结构、骨生物力学和骨代谢的机制探讨

目的:研究补肾中药龟板对激素性骨质疏松大鼠骨量、骨微细结构、骨生物力学和骨代谢指标的改善作用,并对其分子机制进行探讨。方法:40只4月龄SD大鼠随机分为4组:空白组、模型组、阿伦磷酸钠组和龟板组。模型组、阿伦磷酸钠组及龟板组皮下注射地塞米松造模,成功后分别用0.9%氯化钠溶液、阿伦磷酸钠和龟板进行灌胃。12周后取大鼠腰椎(L1-6)和血清进行检测:双能X线检测腰椎骨量、micro-CT检测腰椎骨微细结构、压缩实验检测腰椎生物力学,HE染色观察腰椎形态学改变,ELISA检测大鼠PINP和β-CTX水平表达,q PCR检测腰椎Runx2、SP-7、CTSK和AP-1的m RNA表达。结果:空白组、龟板组及阿伦磷酸钠组骨密度、骨矿物质含量、骨表面积、骨小梁数量、骨小梁厚度、压缩强度明显高于模型组(P<0.05,P<0.01),骨小梁间距、PINP和β-CTX水平、CTSK m RNA表达水平明显低于模型组(P<0.05,P<0.01)。结论:补肾中药龟板可能通过降低骨转换有效改善激素性骨质疏松;CTSK可能是龟板改善激素性骨质疏松大鼠骨量、骨微细结构、骨生物力学和骨代谢的作用靶点之一。

HPLC-ELSD法测定醋龟甲中羟脯氨酸

目的建立一种测定未衍生化氨基酸的方法,测定醋龟甲中羟脯氨酸。方法以高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)法,采用Prevail C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,以乙腈-0.7%三氟醋酸溶液(含5.0 mmol/L七氟丁酸)为流动相进行洗脱,洗脱时间为25 min。结果羟脯氨酸峰面积的自然对数与相应浓度的自然对数呈良好的线性关系,其方程为Y=1.212 4 X+7.803 4,r=0.999 6,羟脯氨酸的线性范围为0.1～1.0 mg/mL,平均加样回收率为101.7%,RSD为2.7%。结论该法快速、简便、准确,可作为醋龟甲药材的质量控制方法。

龟甲水提液调控NF-κB炎症微环境对MC3T3-E1成骨分化的影响

目的:探讨龟甲水提液调控核转录因子-κB(NF-κB)炎症微环境促小鼠前成骨细胞系(MC3T3-E1)成骨分化的作用及机制。方法:体外培养MC3T3-E1细胞,并进行成骨诱导,龟甲水提液干预。实验分为空白组、成骨诱导组、龟甲水提液(20 mg·L^-1)联合成骨诱导组。细胞增殖毒性检测试剂盒(CCK-8)法检测MC3T3-E1增殖能力,并确定最佳干预浓度;碱性磷酸酶(ALP)染色和茜素红(ARS)染色检测MC3T3-E1成骨分化能力;实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测NF-κB p65,NF-κB p105,白细胞介素-6(IL-6),ALP和Ⅰ型胶原(COL-Ⅰ)mRNA的表达。结果:CCK-8结果显示,随着时间的增长,MC3T3-E1增殖虽无统计学差异,但呈上升趋势,而在20 mg·L^-1质量浓度时增殖较其他组明显;ALP和ARS染色结果显示,成骨诱导组和龟甲水提液联合成骨诱导组染色阳性率较空白组明显升高;Real-time PCR结果显示,龟甲干预第7天,与空白组比较,龟甲水提液联合成骨诱导组NF-κB p105和IL-6 mRNA的表达明显降低(P<0.01),ALP和COL-ⅠmRNA的表达明显升高(P<0.05);龟甲干预第14天,与空白组比较,龟甲水提液联合成骨诱导组NF-κB p65,NF-κB p105和IL-6 mRNA的表达明显降低(P<0.01),ALP和COL-ⅠmRNA的表达明显升高(P<0.05,P<0.01)。结论:龟甲水提液能够促进MC3T3-E1成骨分化,其机制可能与抑制NF-κB炎性微环境有关。

HPLC-DAD同时测定左归丸药液中没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、马钱苷、阿魏酸含量

目的:建立同时测定左归丸药液中没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、马钱苷、阿魏酸5种化学成分含量的分析方法。方法:采用HPLC-DAD多波长切换-梯度洗脱技术。色谱柱:Eclipse XDB-C_(18)(4.6 mm×250 mm,5μm);流动相:甲醇-1%醋酸水溶液,梯度洗脱;流速:1.0 m L·min^(-1);分别以各成分的最大吸收波长为检测波长;柱温:30℃。结果:左归丸药液中没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、马钱苷、阿魏酸5种成分均具有良好的线性关系(r≥0.999),平均加样回收率为97.76%~101.8%(RSD<3%,n=6)。3批样品中没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、马钱苷、阿魏酸含量分别为0.489 0~0.500 6、0.104 4~0.108 4、0.048 56~0.050 66、1.042~1.061、5.287×10-3~5.369×10^(-3) mg·m L^(-1)结论:该方法经方法学验证,可用于左归丸药液及其制剂的质量控制。

复合聚合酶链反应鉴别龟甲正品与伪品的特征

目的探讨复合聚合酶链反应（PCR）技术鉴别中药材龟甲真伪的分子标记特征。方法采用盐析法提取龟甲正品及其伪品线粒体DNA（MitochondrialDNA，mtDNA）。从GenBank数据库中下载乌龟mtDNA细胞色素b（cytochromeb，Cytb）和细胞色素C氧化酶亚基I（cytochromeoxidasesubunit I，CoD的基因序列，用Premier5．0设计2对特异性引物，建立复合PCR技术对龟甲正品及其伪品进行扩增并测序。结果盐析法提取的龟甲mtDNA的大小均为16．6×10。bp，正品龟甲经复合PCR扩增在300～500bp间有2条明亮分明的条带，而伪品龟甲只出现1条或无条带。结论复合PCR技术鉴别龟甲真伪具有高度特异性、简便、准确、快捷、实用性强，对龟甲类药材的鉴定有很高的应用价值及准确性。，