基于 bla CARB-17 基因建立水产品中副溶血弧菌的环介导等温扩增技术检测方法

以β内酰胺酶编码基因-17(class A carbenicillin-hydrolyzingβ-lactamase family-17,bla CARB-17)为靶标,建立一种检测水产品中副溶血弧菌的高特异性环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术。用Bacillus stearothermophilus(Bst)DNA聚合酶于63℃反应60 min,扩增副溶血弧菌ATCC17802的bla CARB-17基因,产物用质量浓度20 g/L琼脂糖凝胶电泳和SYBR Green I染色鉴定,优化体系的主要参数。用5株食源性病原菌作对照,验证体系的特异性;将基因组倍比稀释确定其灵敏度;稀释菌液涂抹新鲜虾样品做污染模拟实验,并对实际样品检测分析其可靠性。优化后体系中Mg 2+最适浓度为2.4 mmol/L,dNTPs最佳反应浓度是0.96 mmol/L,Bst DNA聚合酶最适用量是4.8 U,内外引物浓度比是8∶1,最佳反应条件是65℃、60 min。特异性实验显示仅副溶血弧菌为阳性;体系最低检测限为3.64×102 ng/μL;模拟实验的最低检测限为10 CFU/mL;实际样品LAMP检测与PCR符合率100%。该研究建立的LAMP方法操作简便、特异性强、灵敏性高,可用于现场快速检测副溶血弧菌。

基于blaCARB-17和toxR基因的副溶血弧菌双重PCR检测方法的建立

建立一种针对副溶血弧菌bla_(CARB-17)和toxR基因的双重PCR检测方法。按照副溶血弧菌的bla_(CARB-17)和toxR基因序列设计并合成引物,于同一反应体系中进行PCR扩增,优化退火温度、退火时间和引物比例,确定双重PCR的特异性和灵敏性,最后用实验室分离鉴定的副溶血弧菌分离株验证。结果表明:建立的双重PCR最佳退火条件是52℃30 s,引物比例1∶1,在同一体系中特异地扩增出副溶血弧菌的bla_(CARB-17)和toxR基因的303、350 bp片段,其它对照菌株均无扩增,表明该方法特异性良好。双重PCR的最低检测限达1×10~2 CFU/mL,对实验室鉴定的56个副溶血弧菌分离株验证均为阳性。建立的双重PCR方法操作简单、高效快速、特异性强,适用于副溶血弧菌的检测。