CB2受体激活对慢性PD模型小鼠运动功能和黑质胶质细胞活化影响

目的通过行为学、免疫印迹技术及免疫组织化学技术探讨大麻素Ⅱ型(CB2)受体对1-甲基-4-苯基吡啶(MPTP)诱导的慢性帕金森病(PD)模型小鼠运动功能、黑质(SN)区酪氨酸羟化酶(TH)蛋白表达及小胶质细胞和星形胶质细胞活化的影响。方法将30只8周龄雄性C57BL/6野生型(WT)小鼠随机分为WT对照组(A组)、WT MPTP组(B组)、WTCB2受体激动剂(JWH133)组(C组)、WT MPTP+JWH133组(D组)和WT MPTP+JWH133+CB2受体拮抗剂(AM630)组(E组),12只8周龄雄性CB2受体敲除(CB2-KO)C57BL/6小鼠随机分为CB2-KO对照组(F组)和CB2-KOMPTP组(G组)。模型组小鼠首先腹腔注射20μg/(kg·d)AM630和(或)10μg/(kg·d)JWH133,每天1次,连续注射30d;然后腹腔注射30mg/(kg·d)的MPTP,每周2次,持续4周。对照组小鼠腹腔注射等量的生理盐水。应用行为学实验检测各组小鼠爬杆与转棒时间,免疫印迹技术检测SN区TH蛋白的表达,免疫组织化学染色检测SN区小胶质细胞和星形胶质细胞数量和形态变化。结果与A组相比,B组小鼠爬杆时间增加,转棒时间减少;与B组相比,D组小鼠爬杆时间减少,转棒时间增加;与D组相比,E组小鼠爬杆时间增加,转棒时间减少;与F组相比,G组小鼠爬杆时间增加,转棒时间减少。上述差异具有统计学意义(F=29.70、45.45,q=4.87~18.09,P<0.05)。与A组相比,B组小鼠SN区TH蛋白表达水平下降;与B组相比,D组小鼠SN区TH蛋白表达水平上调;与D组相比,E组小鼠SN区TH蛋白表达水平下降;与F组相比,G组小鼠SN区TH蛋白表达水平下降。上述差异具有统计学意义(F=24.88,q=5.09~8.88,P<0.001)。小鼠SN区活化的小胶质细胞和星形胶质细胞计数显示,与A组相比,B组明显增加;与B组相比,D组明显减少;与D组相比,E组明显增加;与F组相比,G组明显增加。上述差异具有统计学意义(F=269.80、708.50,q=13.29~54.78,P<0.01)。结论激活CB2受体能够改善MPTP诱导的慢性PD模型小鼠的运动功能障碍,抑制小鼠SN区小胶质细胞和星形胶质细胞的活化。

电针对佐剂性关节炎大鼠病灶局部皮肤CB2受体阳性细胞免疫反应性的影响

目的:研究电针缓解炎性痛的机制是否与其对病灶局部内源性大麻素2型受体(CB2受体)阳性细胞免疫反应性的影响有关。方法:采用健康成年雌性SD大鼠共48只,随机分为:空白对照组(n=12)、模型组(n=12)、穴位电针组(n=12)和非穴位电针对照组(n=12)。除空白对照组外其它各组大鼠于左后肢外踝关节皮下注射完全弗式佐剂(CFA,Sigma公司产品)50μL制备单发局限性佐剂性关节炎模型。对其进行行为学观察,研究电针患侧“环跳”穴、“阳陵泉”穴对背屈、跖屈踝关节疼痛试验评分的影响,并结合免疫组化技术,观察电针对佐剂性关节炎大鼠致炎后第6天和第16天病灶局部皮肤CB2受体阳性细胞免疫反应性的影响。结果:①电针佐剂性关节炎模型大鼠致炎足同侧穴位,可产生明显镇痛作用,且电针效果在致炎后第3-5天最为显著,穴位电针组背屈、跖屈踝关节疼痛试验评分在致炎第3天和5天均较模型组和非穴位电针对照组显著降低(P<0.05)。②免疫组化结果显示,致炎后第6天穴位电针组大鼠炎性痛病灶局部皮肤组织CB2受体阳性细胞的数量显著高于空白对照组、模型组和非穴位电针组(P<0.05);致炎后第16天穴位电针组该值与空白对照组、模型组和非穴位电针组间统计学差异不明显(P>0.05)。结论:电针腧穴可使炎症病灶局部皮肤组织CB2受体免疫反应阳性细胞的数量显著上调,从而调控炎性痛病灶局部组织中致炎致痛物质与镇痛物质之间的平衡,解除局部病灶神经免疫微环路的激活状态,通过外周途径缓解疼痛。

脂筏在CB2受体介导的内源性大麻素AEA抑制大鼠肝星状细胞增殖活性中的作用

目的探讨脂筏在内源性大麻素受体2(CB2)介导的内源性大麻素(AEA)抑制大鼠肝星状细胞(HSC)增殖活性中的作用及作用机制。方法构建大麻素受体2shRNA(Cnr2-shRNA)转染HSC细胞,干扰CB2受体的表达,采用MTT法检测转染前后不同浓度的AEA和甲基-β-环糊精(MCD)对HSC的作用效应;采用Western blot检测不同浓度AEA及MCD作用后HSC中P38丝裂原活化蛋白激酶(p-P38MAPK)和c-Jun氨基端激酶/应激活化蛋白激酶(p-JNK)的表达量;采用激光共聚焦法检测HSC上的脂筏(LRs)以及CB2受体的表达;蔗糖密度梯度离心法提取脂筏,Westernblot鉴定脂筏并检测脂筏中CB2受体的表达。结果成功构建Cnr2-shRNA转染筛选Cnr2-单克隆细胞株,MTT检测发现转染后CB2受体的减少能减弱AEA对HSC细胞增殖的抑制作用,然而用MCD预处理HSC细胞后CB2受体的减少对AEA的效应无明显影响。p-P38MAPK和p-JNK的表达与AEA浓度有依赖关系,且可以被MCD部分拮抗。CB2受体在HSC膜脂筏和胞质中均有表达,但用蔗糖密度梯度离心法提取AEA刺激前HSC细胞脂筏,发现未受AEA刺激时脂筏中含有的CB2受体量很少,CB2受体大部分存在于HSC细胞胞质中。结论 CB2受体参与AEA抑制HSC细胞增殖的过程与脂筏相偶联,通过脂筏这个信号平台AEA的刺激可能使CB2受体聚集或增多从而发挥级联放大效应,且这一效应与细胞中p-P38MAPK和p-JNK信号途径的激活有关。脂筏和CB2受体介导的信号传导途径可能成为治疗肝纤维化有效的作用靶点。

CB2受体激动剂JWH133对百草枯中毒致急性肺损伤大鼠的保护作用

目的:研究大麻素CB2受体激动剂JWH133对百草枯中毒致急性肺损伤大鼠的保护作用。方法:72只SD雄性大鼠随机平均分成4组。百草枯中毒组:按照20 mg/kg剂量腹腔注射;低剂量JWH133预处理组:在给予百草枯腹腔注射前1 h腹腔注射5 mg/kg JWH133;高剂量JWH133预处理组:在给予百草枯腹腔注射前1 h腹腔注射20 mg/kg JWH133;正常对照组:1 m L生理盐水腹腔注射。在注射百草枯后8 h、1 d和3 d时,收集动脉血、肺泡灌洗液和肺组织标本。采用血气分析仪测定动脉血氧分压(Pa O2),采用ELISA方法检测支气管肺泡灌洗液中IL-1β和TNF-α含量,行组织切片HE染色进行肺损伤评分,利用Western blotting方法检测肺组织中NF-κB和AP-1蛋白表达水平。结果:与正常对照组相比,百草枯中毒组大鼠的动脉血Pa O2明显下降,肺组织结构破坏,肺泡间质水肿,肺损伤指数增加,支气管肺泡灌洗液中炎性细胞因子IL-1β和TNF-α含量明显增加。JWH133预处理,尤其是高剂量JWH133可以减轻肺组织损伤程度,降低支气管肺泡灌洗液中IL-1β和TNF-α含量,减少肺组织中NF-κB和AP-1蛋白的表达。结论:应用CB2受体激动剂JWH133可以抑制百草枯中毒大鼠肺组织中NF-κB和AP-1蛋白的表达,减少炎性细胞因子IL-1β和TNF-α的分泌,减轻百草枯中毒导致的急性肺损伤。

基于CB2受体活化探讨CD4+T细胞分化缓解中性粒细胞大鼠哮喘模型的作用机制

目的分析JTE-907(大麻素类CB2受体反向激动剂)对中性粒细胞大鼠哮喘模型的治疗效果,并通过观察其对CD4+幼稚T细胞分化影响来确定CB2受体活化的潜在治疗机制。方法采用大鼠脾脏分离的T淋巴细胞Th系特异性分化系统分析JTE907对T细胞亚型分化的影响。通过qRT-PCR检测Tbx21、Gata3、白介素(IL)-9、维甲酸受体相关孤儿受体(ROR)-C、FoxP3、CNR2 mRNA表达。将40只动物随机分为4组(n=10):正常对照组、模型组、JTE-907低剂量组(JTE-907-L,腹腔注射5 mg/kg)和JTE-907高剂量组(JTE-907-H,20 mg/kg)。除正常对照组外,其他组的大鼠建立中性粒细胞性哮喘模型。采用ELISA试剂盒检测血清中OVA特异性IgE和BALF中细胞因子水平,流式细胞术检测脾脏中Th17和Treg细胞百分比,Western blot检测肺组织中RORγt、Foxp3和STAT5蛋白的表达。结果qRT-PCR结果显示,JTE907在所有测试浓度下诱导FoxP3和CB2受体的表达。OVA致敏和LPS刺激后,模型组大鼠血清中OVA-sIgE水平上调(P<0.05),并且BALF中中性粒细胞数和干扰素(IFN)-γ、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-17和IL-5水平增加(P<0.05)。JTE-907治疗逆转了上述变化(P<0.05)。此外,与模型组相比,JTE-907治疗组大鼠脾脏中Th17/Treg比例降低(P<0.05)以及肺组织中RORγt蛋白水平降低(P<0.05),而Foxp3蛋白和STAT5的磷酸化水平增加(P<0.05)。结论CB2受体的激活对Th-17介导的中性粒细胞哮喘大鼠有一定的保护作用,其作用机制包括改善Th17/Treg平衡以及调节其各自的细胞因子水平。

内源性大麻素CB2受体拮抗剂AM630对电针镇痛作用的影响

目的：研究内源性大麻素2型受体（CB2受体）拮抗剂AM630对电针镇痛作用的影响。方法：本课题组采用健康成年雄性SD大鼠共50只，随机分为五组：空白对照组（n=10）；炎症组（n=10）；电针治疗组（n=10）；电针＋CB2拮抗剂AM630组（n=10）：电针＋溶媒对照组（n=10）。除空白对照组外其它各组大鼠于左后肢外踝关节皮下注射完全弗式佐剂50μl，制备单发局限性佐剂关节炎模型，

不同浓度CB2受体激动剂预处理对大鼠海马神经元凋亡的保护作用及机制

目的探讨CB2受体激动剂AM1241预处理对缺氧/复氧后大鼠海马神经元凋亡的影响。方法离体培养的大鼠海马神经元,随机分成6组:对照组(Con组),细胞未做特殊处理。CoCl_2组:300μM CoCl_2预处理4 h后,正常培养基继续培养24 h,然后用无血清培养基培养。AM1241 1μmol/L组、AM1241 3μmol/L组、AM1241 5μmol/L组、AM1241 10μmol/L组:培养孔中分别加入浓度为1、3、5、10μM AM1241处理2 h后,加入300μM的Co Cl2处理4 h,然后更换正常的培养基培养24 h,之后更换无血清的培养基培养。MTT法测定细胞增殖,RT-PCR技术检测bcl-2、caspase-3、iNOS mRNA的表达。结果与AM1241 1μmol/L组和AM12413μmol/L比较,AM1241 5μmol/L组和AM1241 10μmol/L组预处理明显增加海马神经元的增殖能力(P<0.05或P<0.01),上调bcl-2 mRNA的表达,下调促凋亡基因caspase-3和iNOS mRNA的表达(P<0.05或P<0.01)。结论 5μM和10μM AM1241预处理通过对凋亡相关基因的调控,对缺氧/复氧后的海马神经元有保护作用。

大麻素CB2受体通过调节大鼠库普弗细胞极化防治酒精性肝病

巨噬细胞的激活有多种形式，主要是经典激活途径（classicalactmated macrophage，M1型）以及替代激活途径（alternativeactibated macrophage，M2型）。M1型的激活主要由CD4＋辅助性T细胞（Thl）型细胞因子、细菌内毒素、外毒素（LPS）、颗粒巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF及TNF-a介导，其结果促进大量炎症因子的释放及化学趋化因子配体的产生，

CB2受体激活对MPP^+致SH-SY5Y细胞损伤的保护作用

目的研究大麻素Ⅱ型(CB2)受体激活对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP +)致SH-SY5Y细胞损伤的保护作用。方法 根据药物处理的不同将细胞分为正常对照组(C组)、MPP +组(M组)、JWH-133/MPP +组(J+M组)以及JWH-133/AM630/MPP +组(J+A+M组)。用免疫印迹法检测各组细胞CB2受体和酪氨酸羟化酶(TH)蛋白的表达,用流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位(ΔΨm)的变化。结果 与C组相比,M组的CB2受体蛋白表达下降( P <0.01);经JWH-133预处理后,CB2受体蛋白表达高于M组( P <0.01),此作用可被AM630所阻断;与C组相比,M组的TH表达降低( P <0.05),经JWH-133预处理后,TH表达高于M组( P <0.05),AM630预处理可抑制此作用;与C组相比,M组细胞的ΔΨm明显下降( P <0.01),经JWH-133预处理后,细胞ΔΨm下降幅度变小( P <0.01),此作用可被AM630所阻断。结论 CB2受体激活可以抑制MPP +对SH-SY5Y细胞的损伤作用。

激活CB_(2)受体对MPP+诱导BV2小胶质细胞iNOS和Arg-1表达的影响

目的探讨激活大麻素Ⅱ型受体(CB_(2)受体)对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)处理的BV2小胶质细胞M1/M2表型转化的影响。方法培养BV2小胶质细胞,将其分为对照组、MPP+组、JWH133(CB_(2)受体激动剂)+MPP+组、AM630(CB_(2)受体抑制剂)+MPP+组、JWH133+AM630+MPP+组。应用免疫印迹法检测各组诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和精氨酸酶-1(Arg-1)蛋白的表达。结果与对照组相比,MPP+组BV2小胶质细胞iNOS蛋白表达明显上升(F=9.825,q=6.346,P<0.01);JWH133预处理抑制MPP+诱导的iNOS蛋白的上调(q=5.714,P<0.01),此抑制作用可被AM630逆转(q=4.154,P<0.05)。与MPP+组相比,JWH133预处理显著上调Arg-1蛋白表达水平(F=5.800,q=5.520,P<0.01),此作用可被AM630所阻断(q=4.155,P<0.05)。结论激活CB 2受体可抑制MPP+处理的BV2小胶质细胞M1极化,并且促进BV2小胶质细胞从M1型转化为M2型。

大麻素CB2受体参与电针预处理诱导的延迟相脑保护作用

目的探讨大麻素CB2受体在电针预处理诱导的脑缺血耐受中的作用。方法实验1：成年雄性SD大鼠40只按随机数字表法分为5组：大脑中动脉闭塞（MCAO）组、电针（EA）＋McA0组、CB2受体拮抗剂（AM630）＋EA＋MCAO组、AM630的溶剂（V）＋EA＋MCAO组和AM630＋MCAO组（n=8），线拴法制作MCAO模型，EA预处理在模型前2h给予，AM630或其溶剂在模型前5．5h给予，于模型后72h行神经功能评分和2，3．5．氯化三苯基四氮唑（TTC）染色检测脑梗死容积百分比的变化；实验2：成年雄性SD大鼠40只分组和处理同上，EA预处理在模型前24h给予，AM630或其溶剂在模型前27．5h给予，检测指标的时间和方法同实验1；实验3：成年雄性SD大鼠36只按照随机数字表法分为6组：对照组和EA后2、6、12、18、24h组（n=6）。后5组给予EA处理后在不同时间点应用RT—PCR和WesternBlot检测各组大鼠右侧大脑中CB2受体的表达。结果实验1：与MCAO组和AM630＋MCAO组比较，EA＋MCA0组、AM630＋EA＋MCAO组、v＋EA＋MCAO组大鼠神经功能评分增高，脑梗死容积百分比降低，差异有统计学意义fP〈0．05）：实验2：与MCAO组比较，EA＋MCAO组和V＋EA＋MCAO组大鼠神经功能评分增高，脑梗死容积百分比降低，与EA＋MCAO组比较，AM630＋EA＋MCAO组和AM630＋MCAO组大鼠神经功能评分降低，脑梗死容积百分比增高，差异均有统计学意义（P〈0．05）；实验3：与对照组比较。EA后18h组CB2受体mRNA水平增高，EA后24h组CB2受体蛋白增高，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论CB2受体参与了电针预处理诱导的延迟相脑保护作用。

大麻CB_2受体在中枢神经系统的分布及其激动剂的药理作用

大麻受体分为大麻受体1(CB1)和大麻受体2(CB2),CB2受体主要分布于外周免疫系统,目前研究发现其在中枢神经系统(CNS)也有少量的分布,这可能与其中枢作用密切相关。已有文献报道CB2受体激动剂具有抑制疼痛产生和持续及神经退行性病变等药理学特性,且长期给药不产生明显的精神和躯体依赖等副作用,显示出良好的临床应用前景。为了更好地认识、研究和利用CB2受体及其激动剂,该文综述了CB2受体在CNS的分布及其药理作用特点。

大鼠皮肤大麻CB2受体在mRNA及蛋白水平的表达和组织分布

目的:研究皮肤组织在mRNA及蛋白水平表达大麻CB2受体的情况。方法:RTPCR和免疫印迹方法研究CB2受体在大鼠皮肤的表达,免疫组化方法示CB2受体的组织分布。结果:RTPCR方法可检测到大鼠皮肤、脾脏组织中CB2受体在mRNA水平的表达;Western印迹示大鼠皮肤、脾脏组织匀浆中抗CB2抗体,可检测到41.6×103蛋白带,而同为实质脏器的肝脏无CB2受体表达;免疫组化方法证实CB2受体主要分布于皮肤的表皮组织和真皮毛囊组织。结论:CB2受体在皮肤组织mRNA和蛋白水平均有表达,主要分布于表皮和毛囊组织。CB2受体可能是神经系统调节皮肤功能的桥梁。

大麻素CB2受体激动剂对HSC-T6抗氧化作用的研究

目的探讨大麻素CB2受体激动剂AM1241对大鼠肝星状细胞系（HSC-T6）的作用及其对抗氧化酶的影响。方法用噻唑蓝法分别检测0、20、50、80μmol／L）AM1241和0、10、20、30、40μmol／LAM630干预24h下HSC-T6的存活率，根据实验所测得的细胞存活率选择最佳的用药浓度。将HSC—T6随机分成对照组、氧化应激组、AM1241干预组、AM1241＋AM630拮抗组共4组。除对照组，其余各组用含100mU／L的葡萄糖氧化酶（GO）的低糖DMEM完全培养液培养12h制备细胞氧化应激模型，然后AM1241干预组用含50μmol／LAM1241的低糖DMEM完全培养液培养12h，AM1241＋AM630拮抗组用大麻素CB2受体拮抗剂AM630（20μmol／L）干预2h后，再用含50μmol／LAM1241的依氏低糖完全培养基培养12h；酶联免疫吸附法检测备组HSC—T6培养液上清液中Ⅲ型胶原（ColⅢ）的含量；分光光度法检测各组HSC—T6中谷胱甘肽（GSH）的含量；Westernblot法分别检测HSC-T6中CB2受体与血红素加氧酶1（HO-1）蛋白的表达量。多组间比较用单因素方差分析。结果AM1241各浓度组明显抑制HSC—T6的增殖且呈现浓度依赖性（P〈0．05），80μmol／L时抑制作用最大，细胞存活率为41．61％±3．13％（P〈0．05）。AM630各浓度组对HSC—T6的增殖无明显抑制作用（P〉0．05）；各组中的HSC—T6可以表达CB2受体，与对照组相比，AM1241干预组CB2的表达量有所增高（P〈0．05）；与对照组相比，氧化应激组ColⅢ的表达量明显升高（P〈0．05），AM1241干预组ColⅢ的表达较氧化应激组明显减低（P〈0．05），而AM1241＋AM630拮抗组ColⅢ的表达与AM1241干预组相比明显增高（P〈0．05），与氧化应激组相比无明显差异；与对照组相比，氧化应激组HO-1、GSH含量有所升高（P〈0．05），AM1241干预组GSH、HO-1含量较氧化应激组相比有所升高，而AM1241＋AM630拮抗组HSC-T6中HO-1、GSH含量较AM1241干预组明显下降（P〈0．05），与氧化应激组差异无统计学意义。结论大麻素CB2受体激动剂AM1241可抑制HSC-T6的增殖与活化，其机制可能与AM1241结合HSC—T6大麻素CB2受体，激活HSC—T6Nrf2转录到细胞核内，启动了抗氧化酶HO-1、GSH蛋白表达量上调，增加HSC-T6的抗氧化作用有关。

大麻素Ⅱ型受体对LPS诱导小鼠黑质区COX-2和iNOS基因表达的影响

目的探索大麻素Ⅱ型(CB2)受体对脂多糖(LPS)诱导小鼠黑质(SN)区炎症反应的作用。方法将18只8周龄雄性野生型(WT)C57BL/6小鼠随机分为WT对照组、WT LPS组和WT LPS+JWH133(CB2受体激动剂)组,12只8周龄雄性CB2受体敲除(CB2-KO)C57BL/6小鼠随机分为CB2-KO对照组和CB2-KO LPS组。对照组小鼠单次双侧SN立体定位注射生理盐水,其余各组小鼠注射等体积的LPS,然后连续腹腔注射JWH133或生理盐水14 d。应用实时荧光定量PCR技术检测各组小鼠SN中环氧化酶2(COX-2)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因的表达。结果与WT对照组相比,WT LPS组小鼠SN区COX-2和iNOS基因表达水平升高,差异有统计学意义(F=20.9、21.4,q=5.536、5.518,P<0.01);JWH133能明显抑制LPS诱导的COX-2和iNOS基因表达上调(q=5.170、4.553,P<0.05);与WT LPS组相比,CB2-KO LPS组小鼠COX-2和iNOS基因表达明显上调,差异有统计学意义(q=4.150、5.496,P<0.05)。结论激活CB2受体能够抑制LPS诱导小鼠SN区COX-2和iNOS基因的表达,缺失CB2受体能够促进LPS诱导小鼠SN区COX-2和iNOS基因的表达。

探讨CB2受体逆向激动剂JTE-907对哮喘模型大鼠中性粒细胞迁移的作用

目的探讨CB2在哮喘中的作用,并通过观察JTE-907(CB2受体反向激动剂)对中性粒细胞(neutrophil,NEU)迁移影响来确定CB2受体活化的潜在治疗机制。方法将30只大鼠随机分为3个实验组:正常对照组,模型组和JTE-907组(JTE-907-L,腹腔注射20 mg/kg),每组10只大鼠。除正常对照组外,其他组大鼠建立NEU性哮喘模型。从大鼠、健康人类志愿者的外周血中分离NEU。采用Western blot分析NEU中CB2、CXC趋化因子受体1(CXC chemokine receptor 1,CXCR1)、CXCR2蛋白表达,酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒检测支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)和外周血白细胞介素8(interleukin 8,IL-8)水平,Transwell迁移试验检测NEU迁移能力。采用支气管上皮细胞(BEAS-2B)和NEU共培养及跨上皮迁移模型,进一步探讨JTE-907对NEU的作用机制。结果JTE-907治疗能够改善NEU哮喘大鼠的支气管气道炎症,并减少BALF和外周血嗜酸性粒细胞和NEU的数量。此外,JTE-907治疗可显著提高NEU中CB2蛋白表达,降低CXCR1和CXCR2表达(P均<0.05)。同样,JTE-907治疗降低了外周血和BALF中IL-8的水平以及NEU迁移。体外实验中,JTE-907治疗以剂量依赖性方式减少NEU迁移,以及降低fMLP诱导NEU中p-磷脂酰肌醇3-激酶(phosphorylated phosphatidylinositol 3-kinase,p-PI3K)和蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)表达水平增加,并降低了聚合F-肌动蛋白的表达。结论JTE-907对NEU哮喘大鼠有一定保护作用,其可能通过下调NEU内PI3K通路,减少哮喘NEU迁移。

基于脊髓大麻素受体CB2介导的MAPK信号通路探讨电针治疗膝骨性关节炎慢性痛的机制研究

目的:观察电针对谷氨酸钠碘乙酸(MIA)诱导的膝骨性关节炎(KOA)慢性疼痛大鼠脊髓背角CB2R及MAPK信号通路相关蛋白表达的影响,从脊髓水平探讨电针治疗KOA慢性疼痛的中枢机制。方法:选取32只SD雌性大鼠,16只左膝关节腔注射MIA法复制KOA慢性疼痛模型,分为模型组(MIA)、电针组(MIA+EA),8只左膝关节腔注射生理盐水为盐水组(Saline),另设8只健康大鼠作为空白组(Blank)。MIA注射14 d后,MIA+EA组行电针干预,选取7个时间点对大鼠进行行为学评价,包括机械痛缩足阈(MWT)和大鼠热缩足潜伏期(TWL),评价模型制备情况及电针镇痛效应;ELISA检测L3-L5脊髓背角中IL-1β及TNF-ɑ含量,Western blot检测L3-L5脊髓背角CB2R及MAPK信号通路相关蛋白p-P38、p-ERK和CREB表达。结果:注射MIA 3 d后,模型组大鼠MWT和TWL较空白组显著下降(P<0.001);与模型组相比,电针干预可明显提高MWT和TWL(P<0.001)。模型组脊髓背角IL-1β和TNF-α含量较空白组明显升高(P<0.01),电针可降低IL-1β和TNF-α含量(P<0.01)。模型组脊髓背角CB2R蛋白表达较空白组上调(P<0.001),p-P38、p-ERK和CREB蛋白表达较空白组显著下调(P<0.01);MIA+EA组脊髓背角CB2R蛋白表达较空白组和模型组均显著上调(P<0.001),p-P38、p-ERK和CREB蛋白表达较模型组显著下调(P<0.01)。结论:脊髓敏化参与MIA诱导的KOA慢性疼痛,电针抑制KOA慢性痛的脊髓机制可能与电针激活脊髓背角CB2受体抑制MAPK信号通路相关。

大麻素CB2受体激动剂AM1241对肝星状细胞影响

目的探讨大麻素Ⅱ型受体(CB2)激动剂AM1241对大鼠肝星状细胞系(HSC-T6)影响及其机制。方法将HSC-T6细胞随机分为对照组、氧化应激组及20、80μmol/L AM1241干预组;对照组正常培养,氧化应激组用含100 m U/L葡萄糖氧化酶(GO)完全培养液培养2 h;AM1241干预组分别加入20、80μmol/L的AM1241干预3 h后,再加入100 m U/L GO干预2 h;细胞免疫化学染色法检测HSC-T6细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达;酶联免疫法检测HSC-T6细胞培养液上清中I型胶原(Col I);硫代巴比妥酸法检测丙二醛含量;氮蓝四唑法检测超氧化物歧化酶(SOD)活力;Western blot检测HSC-T6细胞核转录相关因子(Nrf2)总蛋白与核蛋白含量。结果与对照组比较,氧化应激组HSC-T6细胞胞浆中α-SMA、Col I表达量均增多(P<0.05);与氧化应激组比较,AM1241干预组HSC-T6细胞胞浆中α-SM A、Col I表达量均减少(P<0.05);与对照组比较,氧化应激组HSC-T6细胞中丙二醛含量上升,SOD活性下降(P<0.05);与氧化应激组比较,AM1241干预组HSC-T6细胞丙二醛含量下降,SOD活性上升(P<0.05);对照组、氧化应激组及20、80μmol/L AM1241干预组HSC-T6细胞中Nrf2总蛋白表达量分别为(0.62±0.021)、(0.60±0.015)、(0.59±0.020)、(0.61±0.032),各组差异无统计学意义(P>0.05);与氧化应激组比较,AM1241干预组Nrf2核蛋白表达量均增加(P<0.05)。结论大麻素CB2受体激动剂AM1241可抑制氧化应激作用下HSC-T6细胞活化,其机制可能与AM1241促进HSC-T6细胞中Nrf2发生核内转移,增加抗氧化作用有关。

脊髓背角P2X_4、P2Y_(12)和P2Y_(13)受体参与AM1241对CCI大鼠的镇痛效应

目的观察鞘内注射大麻素CB2受体激动剂AM1241对慢性坐骨神经结扎(CCI)大鼠机械痛阈、脊髓背角P2X4、P2Y12和P2Y13受体表达变化的影响。方法健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠40只随机分为5组(n=8):假手术组、CCI组(坐骨神经结扎+鞘内注射0.005%DMSO生理盐水)、1 pmol/LAM1241处理组(坐骨神经结扎+鞘内注射AM1241 1pmol/L)、10 pmol/LAM1241处理组(坐骨神经结扎+鞘内注射AM1241 10 pmol/L)、100 pmol/LAM1241处理组(坐骨神经结扎+鞘内注射AM1241 100 pmol/L)。CCI组及不同浓度AM1241处理组大鼠均于鞘内置管7 d之后行坐骨神经结扎,连续14 d鞘内注射,每天2次;分别在术前1 d,术后第1、3、5、7、10、14天注射1 h后测定机械痛阈(MWT),分别在术后第7,14天免疫印迹法(western blot)观察脊髓背角P2X4、P2Y12和P2Y13受体表达变化。结果 1CCI组术后第1、3、5、7、10、14天MWT显著低于假手术组(P<0.05),10 pmol/L AM1241和100 pmol/L AM1241处理组术后第1、3、5、7天MWT明显高于CCI组(P<0.01);但10 pmol/L AM1241处理组术后第10、14天MWT与CCI组相比无明显差异(P>0.05);100 pmol/L AM1241处理组术后第10、14天MWT仍高于CCI组(P<0.05);2与假手术组相比,CCI组术后第7、14天脊髓背角P2X4、P2Y12和P2Y13受体表达显著上调(P<0.01);与CCI组相比,100 mol/L AM1241处理组在术后第7天抑制脊髓背角P2Y12和P2Y13受体表达(P<0.05),在术后第14天抑制背角P2X4受体表达(P<0.05)。结论大麻素CB2受体激动剂AM1241的镇痛效应可能与抑制脊髓背角小胶质细胞P2X4、P2Y12和P2Y13受体表达有关。

人二型大麻受体基因的pIRES2-EGFP质粒的构建及其真核表达

目的:构建含有人二型大麻素受体(CB2)基因的真核表达载体,并实现其在HEK293细胞的表达。方法:首先采用PCR方法从含有CB2基因的质粒pcDNA3.1(+)-CB2中扩增获得人的CB2基因,再采用基因重组技术将CB2的DNA片段插入真核表达载体pIRES2-EGFP。将获得的pIRES2-EGFP-CB2重组子转染HEK293细胞,应用荧光显微镜观察EGFP的表达情况,RT-PCR和报告基因检测CB2的表达情况。结果:酶切和测序结果验证真核表达载体pIRES2-EGFP-GB2构建成功。可在荧光显微镜下观察到转染HEK293细胞表达的绿色荧光;RT-PCR和双荧光素酶报告基因法检测证明CB2蛋白在真核细胞中成功表达;CB2受体激动剂JWH-015能显著逆转腺苷酸环化酶激动剂forskolin诱发的荧光素酶活性增加。结论:成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP-CB2,为进一步研究CB2基因的生理学和病理生理学功能及调控机制奠定了实验基础。