豌豆CBF基因家族的生物信息学及低温胁迫下的表达分析

【目的】为了更加全面地探究CBF基因家族在豌豆中的进化及生物学特征。【方法】通过生物信息学方法从基因家族鉴定、结构分析、蛋白基本理化性质、亚细胞定位、染色体定位、顺式作用元件、蛋白质相互作用与表达分析等方面,对豌豆PsCBF基因家族进行系统鉴定和分子特征分析。【结果】在豌豆中共鉴定出21个PsCBF基因,染色体定位显示18个PsCBF基因分布在1、2、4、6与7号染色体上,其余3个未组装到染色体上(PsCBF19~PsCBF21)。21个PsCBF基因编码蛋白的氨基酸数在123(PsCBF09)~349(PsCBF11),且均属于疏水性蛋白。亚细胞定位预测显示18个PsCBF基因(85.71%)定位在细胞核上,二级结构主要以无规则延伸为主。蛋白基序显示同一类群的基因都具相似的保守基序特征且该家族成员包含1~7个保守基序;同一类群的基因也具有相似的基因结构,且该家族基因含1~2个外显子。PsCBF基因启动子区分析表明其含有多种顺势作用元件,在激素反应,组织特异表达以及逆境响应中起作用。蛋白聚类网络图显示其蛋白可能在豌豆应对非生物胁迫中起调节作用。此外,本研究发现低温胁迫后K2SiO3处理下大部分PsCBF基因的表达发生显著变化。【结论】本研究结果将为进一步分析豌豆PsCBF转录因子调控碗豆生物学过程及功能、碗豆抗寒的分子鉴定以及抗寒资源创新利用研究提供参考依据。

西伯利亚杏全基因组CBF基因家族鉴定及低温胁迫下的表达模式

【目的】利用西伯利亚杏全基因组数据库鉴定CBF家族成员,并分析CBF转录因子保守域特点与功能及其在低温胁迫下的表达情况。【方法】根据西伯利亚杏全基因组数据库,利用BLASTP和HMM Search搜索西伯利亚杏CBF基因,通过CDD和MEME验证其保守结构域。使用Prot-Param、WOLF PSORT、MAGA X、Phyre2、PlantCARE等生物信息学工具分别分析蛋白理化性质、亚细胞定位、系统发育、蛋白三级结构、染色体定位及顺式调控元件。利用实时荧光定量PCR分析西伯利亚杏CBF基因在低温胁迫后的表达模式。【结果】本研究共鉴定出4个西伯利亚杏CBF基因,它们均具有AP2基因家族保守结构域PKKPAGR和DSAWR序列。西伯利亚杏CBF蛋白包含206~246个氨基酸,蛋白理论分子量平均值为25.80 KDa,平均等电点为5.92。PsCBF3和PsCBF4在基因结构上较为相似,亲缘关系更近。4个PsCBFs亚细胞定位均位于细胞核内。启动子顺式作用元件分析结果显示CBF家族成员可参与植物激素和非生物胁迫响应。西伯利亚杏CBF成员均属于酸性和亲水性蛋白。低温胁迫后,CBF基因主要在早期(15 min)表达量较高。【结论】本研究提供了较为完整的西伯利亚杏CBF基因家族信息,为了解PsCBF在西伯利亚杏低温胁迫多个时期的复杂机制和途径提供了新的依据,为进一步研究CBF家族成员的生物学功能奠定了重要的理论基础。

小麦、野生二粒小麦、大麦CBF基因家族比较分析

CBF(C⁃repeat⁃binding factor)是植物响应低温胁迫的主要转录因子。对小麦、野生二粒小麦、大麦CBF基因家族进行了全基因组鉴定和比较分析,并采用生物信息学技术对CBF基因的结构、系统发育、染色体定位、顺式作用元件以及共线性进行了分析,然后利用转录数据分析了该基因在不同胁迫条件下以及不同组织中的表达模式。经鉴定,小麦、野生二粒小麦、大麦CBF基因分别有75、31、19个。CBF基因具有很强的保守性,编码蛋白为亲水蛋白,绝大多数具有单一外显子结构,在第5染色体上集中分布;CBF基因家族存在片段串联重复和染色体倍加现象;不同CBF基因具有不同顺式作用元件。在不同胁迫条件下CBF基因表达水平不同,不同组织中的CBF基因表达水平也不同。由此推测CBF基因结构和功能出现分化可能是植物对不同环境的自适应结果,片段串联重复和染色体倍加是CBF基因家族扩张的驱动力。

油棕CBF基因的克隆及与禾本科植物CBF基因的进化关系

本研究致力于克隆油棕低温相应转录因子基因CBF。以NCBI网站上公布CBF基因设计引物,对油棕的基因组进行扩增,并对其进行回收,转化和测序。总共测了11个克隆,测序结果显示这11个克隆中有3个不同拷贝的CBF基因序列,它们序列之间的同源性分别是99%,92%和91%。将克隆的CBF基因与不同物种的CBF基因进行了聚类分析,分析结果显示:这些不同物种的CBF基因可以分为3类,克隆的油棕的3个CBF基因被聚在一块,此外,油棕CBF基因与HvCBF1,OsDREB1E,HvCBF11以及TaCBF11的同源性较高。采用同源序列法,克隆了3个拷贝的CBF基因,通过Blast比对发现,克隆的CBF基因与NCBI数据库现有的CBF基因具有很高的同源性。这些工作将为油棕抗寒的分子选育奠定基础。

不结球白菜BrCBF基因cDNA全序列克隆及结构特征分析

运用RT-PCR和RACE技术从不结球白菜中克隆到1个抗寒相关基因,命名为BrCBF,基因登陆号为DQ402470。其cDNA全长1 003 bp,含有648 bp的完整开放阅读框,编码216个氨基酸,该基因编码的蛋白序列与拟南芥、荠菜、甘蓝型油菜编码的氨基酸序列有极高的同源性,且具有CBF典型的保守结构域AP2。

椰子CBF基因的克隆研究

为了从分子水平上解析椰子抗寒的机理,以油棕的CBF基因序列设计引物,对椰子的基因组DNA进行PCR扩增,并对PCR产物进行回收、连接、转化以及测序,最后获得了1条DNA序列。这条序列与油棕的CBF基因的同源性高达99%,被证实为CBF基因。将克隆的椰子的CBF基因与禾本科作物的CBF基因进行聚类分析,结果显示:所克隆的CBF基因与HvCBF1、OsDREB1E、HvCBF11和TaCBF11具有较高的同源性。

樱桃CBF基因的克隆及序列分析

CBF(CRT/DRE-binding factor)基因是一种低温响应转录因子基因,CBF蛋白能够与很多低温相关基因的启动子结合,使其表达,从而增强植物抗冷能力。本研究利用已经公布的CBF序列的保守区设计特异引物,对樱桃砧木吉塞拉6号的cDNA进行扩增,成功获得CBF的全长序列。序列分析结果表明,其开放阅读框为723 bp,编码240个氨基酸,具有典型的AP2结构域及CBF特有的两段短肽序列。氨基酸序列同源性分析表明,该CBF与蔷薇科植物同源性较高,与其他科属植物同源性较差。

白菜型油菜CBF基因克隆及功能分析

利用RACE技术从‘陇油6号’油菜中克隆得到1个新的CBF(C-repeat binding factor)基因(GenBank登录号为KP974691),全长1 000bp,其中包括5′-UTR 114bp,3′-UTR 241bp,开放阅读框645bp,编码215个氨基酸,推测的蛋白质分子量23.8kD,理论等电点为4.86。在氨基酸序列水平上,该基因与多种植物具有较高的一致性,其中与萝卜、紫茎泽兰、卷果涩荠和拟南芥的一致性分别为93.5%、83.7%、81.0%、79.0%。实时荧光定量PCR分析表明,CBF基因在油菜的茎、叶和下胚轴中均有表达,没有组织特异性;该基因表达受低温、ABA、H2O2诱导,MAPKK抑制剂U0126预处理12h再经低温、ABA、H2O2诱导,与单独处理结果相比,CBF基因表达明显降低,表明该基因在油菜适应低温、ABA、H2O2胁迫过程中发挥作用。

麻核桃CBF基因的克隆与生物信息学分析

CBF基因是植物CBF抗冷途径的枢纽,对增强植物抗冷能力极为重要。本研究根据已知的核桃CBF基因序列设计通用性引物,对麻核桃cDNA进行PCR扩增,成功获得麻核桃CBF基因全长序列,命名为JhCBF。JhCBF全长820 bp,包含一个645 bp的开放读码框(ORF),编码214个氨基酸。序列分析表明JhCBF与其他物种来源的CBF具有较高的同源性,其中,与桦木科白桦的同源性最高,为61.22%;JhCBF含有一个预测的AP2结构域及CBF特有的两段短肽序列。系统进化树分析表明JhCBF与桦木科白桦的亲缘关系最近,最先聚为一类。

拟南芥CBF基因的克隆

CBFs是拟南芥中能与低温响应元件CCGAC结合的转录因子,通过诱导冷调节基因(COR)的表达从而增强植物的耐冻性。CBFs由一个小的基因家族编码,包括3个成员:CBF1、CBF2和CBF3,在序列上高度相似。我们根据其编码基因的启动子和终止子中的一致序列,设计了一对PCR引物,用一次反应即同时获得了这3个基因的克隆。

抗冻诱导因子CBF基因及其在木本植物的抗寒应用

温度是植物生长发育的必要条件,低温是影响植物生长发育的重要逆境因子,因此抗冻诱导因子CBF基因作为重要的抗逆系列基因成为目前研究的热点之一。系统介绍了CBF基因家族、结构与特性、表达、调节因子、生理生化功能、抗逆条件下的交叉适应现象,及其在木本植物上的应用前景及原理。

山葡萄CBF基因表达载体构建及对拟南芥根生长的影响

为了研究山葡萄CBF基因调节植物对盐胁迫的应答机理,分别构建了山葡萄Va CBF1、Va CBF2和Va CBF3的植物过表达载体。经酶切及琼脂糖电泳检测证实3个基因均插入到p BASTA中,表明表达载体构建成功。然后,分别将3个植物过表达载体转入农杆菌EHA105中,并通过浸花法浸染拟南芥。利用除草剂筛选获得3个基因的拟南芥过表达株系。最后,对野生型拟南芥与转基因拟南芥进行盐胁迫处理,发现OE-CBF2转基因植株的主根伸长长度显著长于其它植株,3个转基因株系的侧根长度也明显长于野生型植株。上述结果表明山葡萄CBF基因可能在植物盐胁迫中对根部生长发育起到非常重要的调控作用。

转录因子CBF基因转化烟草抗寒性指标的检测

为了解棉花转录因子CBF基因转化烟草的抗寒性,将苗龄21 d的转基因及其野生型T2代烟苗进行0、-1、-2、-3、-4℃低温处理4 h,分别进行各处理材料的电解质渗透率、丙二醛含量和可溶性糖含量的检测。结果表明转基因烟草的电导率和丙二醛含量均低于非转基因烟草,而转基因烟草的可溶性糖含量高于非转基因烟草。证实转CBF基因可以提高烟株的抗寒性。

膜荚黄芪CBF基因的克隆及表达分析

为探究膜荚黄芪CBF基因的结构与功能,该试验采用RACE技术克隆得到了膜荚黄芪CBF基因,命名为AmCBF。分析结果表明:AmCBF序列全长cDNA为827 bp,开放阅读框为642 bp,在线分析软件预测其编码213个氨基酸,等电点5.84,分子量24066.86 Da,是亲水性蛋白,定位于细胞质中。实时荧光定量PCR分析结果表明:AmCBF在低温和干旱胁迫时基因表达上调,且在低温处理时表达量较高。

DREB/CBF基因响应植物抗冷途径的研究进展

低温环境信号通过细胞膜的转导,激活以DREB/CBF途径为主的抗冷信号网络,调控下游大量抗冷功能基因的表达,继而增强植物的抗冷能力。本文重点介绍了国内外近年来有关CBF基因结构特点、CBF转录因子在植物抗逆基因工程中的作用,CBF信号途径的研究包括Ca2+与低温信号转导、CBF转录因子在植物抗冷过程中的表达调控、生物节律调控CBF转录因子的表达等方面,旨在为植物抗逆育种提供理论依据。

梅花PmCBF基因的克隆及表达

CBF转录因子在植物冷驯化中起着重要调控作用。以欧洲甜樱桃CBF基因为信息探针,从李属基因组数据库中得到一个候选序列,设计特异引物,通过PCR扩增和RT-PCR验证,发现与预测序列一致。该基因全长711bp,可编码225个氨基酸,序列分析发现其具有CBF基因的特征序列,包含保守的AP2/EREB DNA结合域以及CBF特征短多肽序列PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR。同源性分析显示,PmCBF和欧洲甜樱桃、矮扁桃CBF基因一致性较高,均在90%以上,与欧洲甜樱桃的氨基酸同源性达100%。实时荧光定量PCR分析发现:4℃低温胁迫下,PmCBF在转录水平的表达情况和其他植物CBF基因一致;4℃处理后PmCBF基因的表达开始上升,4 h时达最大,初步表明PmCBF在低温胁迫下上调表达。

结球甘蓝CBF家族特征分析及低温诱导基因BoCBF1、BoCBF2a和BoCBF3表达分析

转录因子CBF在植物对低温胁迫的响应和增强植物的抗寒性方面发挥着重要作用。为分析结球甘蓝CBF家族成员的氨基酸序列特征,探究其是否受低温诱导表达,本研究利用结球甘蓝923全基因组数据库对其进行蛋白质理化特征、系统发育关系、编码基因结构以及2℃低温胁迫下编码基因表达水平分析。结果表明,共鉴定到7个BoCBF基因,系统发育分析后分成2个亚组(Ⅰ和Ⅱ)。BoCBF蛋白的氨基酸长度为203~283 aa,全部是亲水性蛋白质。在结球甘蓝02-12中,BoCBF1、BoCBF2a和BoCBF3基因在叶、花、芽和角果中基本不表达,在愈伤组织、根和茎中表达量较低。转录组测序和实时荧光定量PCR分析发现,在耐寒结球甘蓝923和不耐寒结球甘蓝D9中,BoCBF2b、BoCBF2c基因不受低温诱导表达,BoCBF2a基因低温诱导表达最为迅速,其次是BoCBF1和BoCBF3基因。BoCBF1、BoCBF2a和BoCBF3基因的相对表达量在低温胁迫3~6 h达到最大值,相对表达量达到最大值后急剧下降,在24 h降至最低。本研究结果为后续开展BoCBF1、BoCBF2a和BoCBF3基因调控结球甘蓝响应低温胁迫机理研究奠定了基础。

石榴低温响应因子CBF基因家族鉴定及其表达分析

CBF(C-repeat binding factor)是AP2家族的一类转录激活因子,在植物响应低温胁迫和提高植物耐寒性方面具有重要作用。虽然多个石榴品种的基因组已经发布,但仍缺乏对其CBF基因家族的全面研究。为全面分析石榴(Punica granatum L.)CBF基因家族分子生物学特性,本文对鉴定到的PgCBFs成员进行了生物信息和表达分析。结果表明,石榴全基因组中有7个CBF基因家族成员,蛋白序列中除包含AP2结构域外,还具有CBF特征序列PKKPAGRxKFxETRHP和DSAWR;7个成员集中分布在染色体1和4上,编码蛋白质氨基酸长度为201~267aa,分子质量为21.69~29.81ku;进化分析显示PgCBFs基因家族成员分布在GroupⅡ~Ⅳ亚组中,与水稻CBF成员组成的GroupⅠ存在明显区分;除PgCBF2、PgCBF4、PgCBF5基因结构中含有1~2个内含子外,其余与其他物种类似,属内含子缺失型;编码的蛋白序列均含有保守基序Motif1~7;蛋白二级结构主要为不规则卷曲和α-螺旋,三级结构较为相似。PgCBFs基因家族扩增主要来源于串联重复,并与拟南芥、苹果、桃分别存在2对、5对和4对共线性关系;GO注释显示PgCBFs多与转录调控、低温胁迫或激素诱导相关;启动子区含有多种顺势作用元件,主要为胁迫刺激、激素诱导和光响应元件;基因表达分析发现除PgCBF6外,其余成员在根中高度表达,在低温胁迫处理下PgCBF在根和韧皮部表达量显著上调,其中PgCBF7能够快速响应并持续应答低温诱导。结合进化树、共线性、启动子以及表达分析,推测PgCBF7可能与石榴幼苗低温胁迫调控相关。本研究可为深入研究石榴CBF基因家族生物学功能提供理论基础。

百香果CBF基因家族鉴定与表达分析

百香果(Passiflora edulis Sims)原产热带地区,对低温十分敏感。CBF(C-repeat binding factor)基因家族是AP2转录因子家族的一类成员,在植物应对低温、干旱和盐等非生物胁迫中发挥重要作用。对百香果CBF基因家族进行鉴定和分析,并探究其在低温胁迫下的表达模式,可为进一步研究百香果CBF基因功能提供重要的参考信息。采用生物信息学方法鉴定百香果CBF基因家族成员,并对家族成员的序列组分、理化性质、系统进化关系、染色体定位、基因结构、保守基序、启动子顺式作用元件和转录因子结合位点等进行分析,通过qRT-PCR方法分析其在低温胁迫下的表达模式。结果显示,百香果基因组中共有5个CBF基因家族成员,其中3个分布在1号染色体上,2个分布在7号染色体上,被预测定位到细胞核、质膜和过氧化物酶体中;含有1~2个外显子,11~12个motif;系统进化显示5个百香果CBF基因、10个水稻CBF基因及6个拟南芥CBF基因共分成了2大亚组:亚组Ⅰ中包括拟南芥的全部6个CBF基因、百香果的全部5个CBF基因和水稻的4个CBF基因,水稻剩下的6个CBF基因分到了亚组Ⅱ中;启动子区域含有25种顺式作用元件,以光响应、激素与逆境胁迫响应元件为主;共有20个转录因子结合位点;3个百香果CBF基因在低温胁迫下表达量极显著上升,推测上述基因参与了百香果低温胁迫响应。

农杆菌介导CBF基因转化木纳格葡萄的分析

为了建立木纳格葡萄稳定、可行的遗传转化体系,本研究以木纳格葡萄的叶片和叶柄为受体材料,分析卡那霉素(Kan)、头孢霉素(Cef)浓度以及筛选方式对木纳格葡萄遗传转化效率的影响,且通过农杆菌介导法转化CBF基因,并对获得的抗性植株进行PCR检测。结果表明,以叶片、叶柄为外植体,Cef的最适浓度为300 mg/L,Kan的临界浓度为5 mg/L,延迟筛选法更适合遗传转化,可减少抑制作用。最终共获得12株抗性植株,经过PCR检测发现5株为阳性转基因植株,初步证明CBF基因已经导入到木纳格葡萄中,遗传转化体系建立成功。该遗传转化体系的建立,为葡萄的基因改良提供了技术支持。