酸性纤维素酶CBHⅡ基因与非抗性穿梭表达载体的重组及在乳酸杆菌的表达及其活性检测

以SmaI和SphI双酶切pMD18-T-CBHⅡ和以胸苷酸合成酶基因(thymidylate synthase,thyA)为选择压力的非抗生素抗性的穿梭表达载体pW425t,胶回收酸性纤维素酶CBHⅡ基因和载体大片段,并将纯化的CBHⅡ基因和表达载体pW425t大片段进行连接,构建出可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的原核表达重组质粒pW425t-CBHⅡ。将pW425t-CBHⅡ转化至thyA基因缺陷型的乳酸杆菌感受态细胞中,通过质粒提取、酶切鉴定、PCR鉴定、测序分析和生长功能弥补筛选阳性克隆。SDS-PAGE分析,可见约49.6 ku的蛋白,并且刚果红染色显示重组乳酸杆菌可产生明显的水解圈。

康宁木霉K801纤维素酶cbh2基因的克隆及序列分析

通过聚合酶链式反应（PCR）技术扩增得到纤维素高产菌株康宁木霉Trichoderma k■ningii K801纤维二糖水解酶（CBHII）基因全序列，并克隆到pGEM-Teasy Vector。序列分析表明，所克隆的cbh2基因长1611bp，包含了纤维二糖水解酶基因的完整编码区序列，并含有三个真核生物典型的内含子序列，其中四个外显子序列共同编码一个471aa的蛋白质。该序列是国内首次克隆得到的cbh2编码区全序列，与国外报道的T. reesei已知序列的同源性达到99.89％,只有两个碱基差别，而推测的氨基酸序列只有一个位置疏水性氨基酸之间发生替代，在推测的氨基酸序列上发现3个潜在的N-糖基化位点。

斜卧青霉114-2 cbh1基因的TAIL-PCR克隆及与抗阻遏突变株JU-A10的比较

【目的】研究斜卧青霉(Penicillium decumbens)114-2与其抗阻遏突变株JU-A10外切酶基因序列的差异。【方法】用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)和RT-PCR扩增得到斜卧青霉114-2外切葡聚糖酶Ⅰ(cbh1)基因全长和cDNA全长。【结果】cbh1基因全长为1500bp,含有两个内含子,编码453个氨基酸(GenBank,EF397602)。克隆并分析了1.9kb的cbh1基因上游序列,分别发现了葡萄糖代谢抑制因子CREⅠ与纤维素酶转录调控蛋白ACEΙ的两个的潜在结合位点。【结论】在相同的培养条件下,其抗阻遏突变株JU-A10的外切酶活明显高于野生株114-2。两菌株的cbh1基因序列完全一致,说明外切酶活明显提高不是由于cbh1基因发生突变引起的。

绿木霉ZY-01的外切葡聚糖酶CBHⅠ基因的克隆及在E.coli中的表达

以前期分离筛选得到的高产纤维素酶菌株TrichodermavirensZY-01的总RNA为模板合成cDNA,经PCR克隆得到外切葡聚糖酶(cellobiohydrolase,CBH)Ⅰ基因;并构建了pET-32a-cbh1表达载体,通过转化至E.coli BL21(DE3)中,获得CBHⅠ重组表达系统,成功表达出可溶性CBHⅠ蛋白。结果表明,Trichoderma virens ZY-01CBHⅠ碱基序列与Trichoderma viride AS 3.3711CBHⅠ基因(GenBank:AY368686.1)序列相似度高达91.95%,氨基酸同源性高达99.22%;通过SDS-PAGE检测,表明该基因在E.coli中得到可溶性表达,分子量约为53kDa,与基因翻译出的氨基酸序列相一致。该研究为CBHⅠ基因的工程化及应用提供了基础。

鹅源草酸青霉CBHⅠ基因克隆及真核表达载体构建

【目的】鹅源草酸青霉F67(Penicillium oxalicum Currie & Thom)纤维素酶二糖水解酶(cellobiohydrolase,CBHⅠ)基因克隆并构建真核表达载体,为该菌株分子特性的进一步研究及构建高效纤维素分解菌奠定基础。【方法】首先通过兼并PCR法扩增CBHⅠ基因片段,然后利用改良热不对称交错PCR(TAIL-PCR)技术克隆CBHⅠ基因5′端和3′端侧翼序列,最后采用RT-PCR法扩增鹅源草酸青霉F67CBHⅠ基因序列全长,并对该基因进行生物信息学分析,构建pPIC9K真核表达载体。【结果】分别扩增到鹅源草酸青霉F67纤维素酶CBHⅠ基因片段A(EU574736)、5′端序列B1(EU603295)、3′端序列B2(EU652768)及全长基因C(EU727171),并成功构建真核表达载体pPIC9K-CBHⅠ;生物信息学分析表明,该基因蛋白序列与微紫青霉氨基酸序列同源性最高,达76%,前26个氨基酸为信号肽序列,疏水性可达2.63,由催化功能域、衔接区和真菌性纤维素结合域构成,其三级结构主要为β-sheet。【结论】鹅源草酸青霉纤维素酶CBHⅠ基因全长序列的克隆进一步丰富了丝状真菌的生物信息学资源;其真核表达载体的构建为将该菌株进一步在真核宿主中表达,从而获得高效工程菌株奠定了基础。

绿色木霉纤维二糖水解酶基因cbhⅡ的克隆及其在粟酒裂殖酵母中的表达

采用粟酒裂殖酵母诱导表达系统进行绿色木霉纤维二糖水解酶基因cbhⅡ的表达研究。通过PCR方法从绿色木霉基因组DNA中克隆到长度为1611bp并含有信号肽序列的cbhⅡ基因;将其插入到粟酒裂殖酵母诱导型表达载体pESP-2的Pnmt1启动子下游,得到重组质粒pESP-2-cbhⅡ;利用电转化方法将其转入粟酒裂殖酵母SP-Q01细胞中,通过对酵母转化子质粒DNA的PCR和双酶切鉴定,得到了含有cbhⅡ基因的酵母转化子,对转化子进行诱导培养后提取酵母总蛋白,进行SDS-PAGE电泳检测,得到一条约为81kD的目的蛋白条带;利用DNS法对酵母转化子上清液中的纤维二糖水解酶活性进行测定,结果表明,酶活力最大值为165U/mL。以上结果证明:cbhⅡ基因在Pnmt1启动子控制下在粟酒裂殖酵母中成功地获得表达,并且cbhⅡ自身的信号肽可以被粟酒裂殖酵母正确的识别,并将表达产物分泌至胞外。

康宁木霉cbh2基因cDNA的克隆及序列分析

采用植物叶总RNA提取试剂盒提取康宁木霉总RNA,利用依据木霉cbh2基因序列设计合成的一对特异性引物,采用RT-PCR方法扩增得到了康宁木霉cbh2基因cDNA,并成功转入大肠杆菌.序列测定结果表明该基因序列与已公布的木霉cbh2基因的同源性最高可达91.93%.

微紫青霉CBHⅠ基因(Cbh1)在体外无细胞系统中的表达

以含Ｃｂｈ１的ｐＵＣ１８－１８１ ＤＮＡ 为模板，经ＰＣＲ扩增得到带有Ｔ７启动子的Ｃｂｈ１片段，随后在缺乏糖基化的兔网织红细胞裂解液中得到成功表达，表达量为２１．７ μｇ／ｍ ｌ．得到的ＣＢＨ Ⅰ虽未经糖基化修饰，却可水解对硝基酚－β－Ｄ－纤维二糖苷（ｐＮＰＣ），对ｐＮＰＣ的ＫＭ 和Ｖｍ ａｘ分别为０．８２ｍ ｍ ｏｌ／Ｌ和０．０６７ μｍ ｏｌ·ｍ ｉｎ－ １·μｇ－ １，但对羧甲基纤维素钠（ＣＭＣ－Ｎａ）无酶活力．这表明，糖基化修饰可能不影响胞外纤维素酶的活力．

康宁木霉cbh2基因的克隆与结构特征分析

克隆得到了康宁木霉AS3.2774的cbh2基因组DNA及cDNA,序列测定表明:基因组DNA全长1583 bp,cDNA全长1413 bp。对比cbh2基因组DNA序列与cDNA序列,证明该基因由4个外显子组成,被3个内含子间断隔开,编码470个氨基酸的多肽。利用Predictprotein软件预测,该蛋白由9个α螺旋结构和10个β折叠结构及其他结构组成,并对其纤维素结构区、2个糖苷水解酶家族6的特征结构区、信号肽等特征性结构区进行了定位。

康宁木霉cbh2基因在毕赤酵母中的表达

为拓宽酵母菌的应用领域,构建具有分泌纤维素酶能力的酵母工程菌,利用质粒pPICZαA构建了康宁木霉纤维素酶cbh2基因的酵母表达载体,经线性化后采用电穿孔法转入毕赤氏酵母菌中.以甲醇为诱导物进行诱导,聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果证明该基因可成功表达.对重组蛋白进行了产酶活性测定,结果证明该重组蛋白具有纤维二糖水解活性,从而获得了一株可产生纤维素酶的酵母工程菌.

康宁木霉AS3.2774纤维素酶CBH Ⅱ基因的cDNA克隆

采用植物叶总RNA提取试剂盒提取康宁木霉AS3.2774总RNA,根据GenBank已发表的纤维素酶CBH Ⅱ基因序列(DQ504304)设计并合成了1对特异性引物,采用RT-PCR方法扩增得到康宁木霉CBH Ⅱ基因cDNA,并成功转入大肠杆菌。序列测定结果表明,该基因序列与GenBank发表的康宁木霉CBH Ⅱ基因序列同源性达到99.86%。

康宁木霉AS3.2774纤维素酶CBHⅡ基因与乳酸菌非抗性穿梭表达载体的重组及在大肠杆菌中的表达

以康宁木霉AS3.2774 m RNA为模板,通过RT-PCR技术,扩增了1 413 bp的CBHⅡ全长基因,利用T-A克隆,将CBHⅡ克隆至克隆载体p MD18-T Simple Vector,构建质粒p MD18-T-CBHⅡ。以Sma I和Sph I双酶切p MD18-T-CBHⅡ和以胸苷酸合成酶基因(thymidylate synthase,thy A)为选择压力的非抗生素抗性的穿梭表达载体p W425t,将纯化的CBHⅡ亚克隆到p W425t中,得到原核表达重组质粒p W425t-CBHⅡ,可在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达。将p W425t-CBHⅡ转化在thy A基因缺陷型的大肠杆菌感受态E.coli X13中,通过质粒提取、PCR鉴定、酶切鉴定、分析测序以及生长功能弥补筛选阳性克隆。SDS-PAGE分析,约49.6 k D的蛋白可见,刚果红染色显示重组大肠杆菌可产生明显的水解圈,并用p NPC法测得重组大肠杆菌的CBHⅡ酶活力在温度50℃、p H值5.0时达到最大。

长期保护性耕作对纤维素降解基因cbh Ⅰ多样性的影响

研究了免耕秸秆覆盖（CntWntS）、耕作秸秆覆盖（CntWtS）、免耕秸秆不覆盖（CntWnt）和耕作秸秆不覆盖（CntWt）四种保护性耕作措施对黄淮海平原典型潮土中纤维素降解菌多样性的影响。采用PCRRFLP技术分别对纤维素降解菌cbh I基因进行多样性分析。结果表明,CntWntS与CntWnt相比,纤维素降解菌的数量增加了148%,而CntWtS与CntWt相比,纤维素降解菌的数量也增加了130%。纤维素降解菌cbh I基因分型在四个处理小区比较丰富,共有44个OTUs,其中CntWntS、CntWtS、CntWnt、CntWt处理中分别有35、34、30、30个OTUs。多样性指数分析显示,Shannon-Wiener指数的数值范围为3.09~3.36。系统发育分析表明,文库中的纤维素降解菌分别属于Basidiomycota（担子菌门）和Ascomycota（子囊菌门）,同时发现土壤中存在大量的未培养纤维素降解菌。因此,免耕和秸秆覆盖等保护性耕作能够明显提高土壤中纤维素降解菌数量和cbh I基因多样性。

启动子cbh1的改造与里氏木霉通用质粒载体的构建

里氏木霉具有优异的表达及分泌异源蛋白的能力。本研究为了提高里氏木霉在工业生产中异源蛋白表达产量,对cbh1启动子中四处葡萄糖反馈抑制位点进行突变,并且成功构建两株定点插入型表达质粒pG与pH。在后续的报告基因红色荧光蛋白DsRed表达过程中,pG比pH表现出更优异的表达能力,并且异源蛋白基因被定点插入了cbh1基因位点而对该基因进行了敲除。pG质粒具有工业应用前景。

cbh1重组菌的构建、产酶条件及酶特性分析

从匍枝根霉TP-02中克隆得到cbh1的c DNA,序列测定分析表明,该基因编码526个氨基酸的蛋白质。通过DS2.5同源模拟分析,CBHI酶的活性部位是一个＂桶状＂的隧道结构。将cbh1基因的c DNA序列克隆到大肠杆菌表达载体p ET22b（＋）中,在大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达。采用两步层析法对重组的CBHI蛋白进行纯化,对纯酶的特性进行分析。结果表明：在异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导终浓度为0.5 mmol/L,诱导温度为20℃,诱导时间为14 h,经过纯化后获得比活力为3.57 IU/mg。重组酶的最适反应温度和p H分别为55℃和5.5,在p H4.5~6.5的范围内稳定性较好,Fe3＋和Co2＋对其具有较强的激活作用;以微晶纤维素为底物,Km值为6.1 mg·m L-1。

PCR对转基因玉米CBH351品系的鉴定检测

成功建立了转基因玉米CBH35 1(StarlinkTM)的筛选和品系鉴定检测的PCR方法。该方法根据玉米自身IVR基因作为内源特异参照基因来检查模板DNA提取的质量 ,避免了假阴性结果 ;设计检测CaMV35S启动子的引物扩增 195bp ,来对转基因玉米进行筛选检测 ;并进一步设计转基因玉米CBH35 1(StarlinkTM)品系转化质粒图谱中CaMV35S启动子和Cry9C边界位置基因特异性引物扩增 170bp ,以及目标基因Cry9C的右端与CaMV35S终止子的左端边界位置基因特异性引物扩增 171bp,以此来鉴定检测CBH35 1(StarlinkTM)的品系。

Trichoderma reesei外切葡萄糖苷酶CBHⅠ对木糖的糖苷合成性质的研究

[目的]探讨Trichoderma reesei外切葡萄糖苷酶CBHⅠ对木糖是否有糖苷合成活性。[方法]以木糖为底物,检测了155min反应体系中还原糖含量的变化,并以GC/MS对反应产物进行定性分析。结果]在封闭的反应体系中,还原糖含量出现规律的周期性上升下[降的特征,在2条回归曲线y=3E-05x+0.7151和y=-0.0002x+0.6276之间呈波状振荡,还原糖含量振荡周期为(33.75±4.79)min,从而推断出CBHⅠ可以以木糖为底物合成非还原性产物。对非还原性产物衍生后进行GC/MS分析,产物中有以木糖为单位的非还原性二糖存在。[结论]CBHⅠ对木糖有糖苷合成活性,这扩大了其在糖苷合成中底物的应用范围。

由拟康氏木霉Trichoderma Pseudokoningii S—38菌株中分离得到的一个新的外切葡聚糖纤维二糖水解酶(CBH)

对拟康氏木霉 Trichoderma Pseudokoningii S—38菌株在玉米秸粉上生长后得到的粗酶液进行了全组分纯化分离。得到了一个物化和酶学性质与已有的外切葡聚糖纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)CBH(cellobiohydrolase)Ⅰ和Ⅱ性质不同的一个可酶解天然纤维素的组分——CBHX。它不水解 CMC(carboxymethy cellulose)、HEC(hydroxyethyl cellulose)、PNPG(P—nitrophyglucoside)和水杨素,但能水解 Avicel 和磷酸膨胀纤维素,在有内切葡聚糖酶存在时则能水解棉花。与 CBHI 在水解 Avicel 或棉花时无协同作用。相对分子质量为340000,等电点7.0。用微热量计测试表明,它可单独作用于棉纤维的结晶区,但检测不出水解产物。

甘草甜素对CBH血清HBV复制指标阴转效果的观察

1989年4月～9月我们对住院的58例慢性乙型肝炎(CBH)患者试用了甘草甜素片治疗,以观察其对乙肝病毒(HBV)复制指标的影响,现将结果报告如下。临床资料全部病例均为住院患者,治疗组58例,男44例,女14例;平均年龄42.4岁;病程8月～12年。对照组40例,男32例,女8例;平均年龄46.7岁;病程10月～10年。所有病例 HBsAg(R-PHA)、

对西澳大利亚CBH谷物处理有限公司考察报告

为了利用世界银行贷款,改善我国粮食流通领域基础设施,建成现代化的东北、长江、西南粮食流通走廊,北京中心库及物流中心、培训中心、信息中心、批发市场等项目。在世界银行建议下,应澳大利亚贸易委员会的邀请,于1993年随中国散粮储运技术考察团,赴西澳大利亚洲的谷物处理有限公司(以下简称CBH公司)及其所属企业进行了考察。此行对建设东北走廓项目及今后经营管理,有很多值得借鉴的经验。