GST pull-down技术验证CIPK7蛋白激酶与CBL1蛋白的相互作用

采用DNA重组技术,构建pGEX-4T-3-CIPK7和pET28-CBL1蛋白表达载体,转化大肠杆菌并诱导表达目的蛋白,利用亲和层析纯化法纯化GST标签、His标签融合蛋白,通过GST pull-down试验验证CIPK7与CBL1之间的相互作用.成功构建了CBL1和CIPK7的重组质粒,经诱导表达及纯化获得了可溶性GSTCIPK7和CBL1-His融合蛋白,GST pull-down试验证实了CBL1能够与CIPK7结合.CIPK7蛋白与CBL1蛋白之间存在直接的相互作用,为进一步研究蛋白激酶CIPK7的功能奠定了基础.

大白菜、甘蓝和黑芥CBL1基因的比较分析

CBL1基因在植物非生物逆境应答及发育过程中具有重要功能。本试验在解析大白菜、甘蓝和黑芥CBL1的基础上,对它们进行了系统地比较分析,为进一步研究CBL1基因在芸薹属植物中的分子进化和功能奠定基础。

大豆类钙调磷酸酶B亚基GmCBL1互作候选蛋白的筛选

Ca2+是非生物胁迫信号转导途径中的重要信号分子,植物类钙调磷酸酶B亚基蛋白(CBL,calcineurin B-like proteins)是一类重要的钙信号受体蛋白,主要通过与其他蛋白的特异结合传递信号,使植物形成对非生物胁迫的响应。本实验室已经获得大豆Gm CBL1基因,功能鉴定显示Gm CBL1增强了转基因拟南芥对非生物胁迫的耐性。为了进一步研究Gm CBL1的作用机理,本研究构建诱饵载体p GBKT7::Gm CBL1,利用酵母双杂交技术筛选大豆Gm CBL1的互作蛋白。通过对筛选获得的106个蛋白基因测序和Blast比对分析,并根据其可能的生理功能对这些候选蛋白归类,整理得到4类蛋白:能量代谢相关蛋白、修饰蛋白、防御蛋白、钙信号转导相关蛋白。筛选得到候选蛋白的功能预测初步表明,大豆Gm CBL1参与多条信号途径,为进一步研究探索大豆CBL介导的抗逆信号转导途径奠定了基础。

胡杨CBL1蛋白溶液的DSC研究

胡杨CBL1蛋白是一类重要的钙信号转导蛋白,在植物应对干旱、低温、高pH等环境胁迫中发挥着重要作用。通过差示扫描量热法,研究胡杨CBL1蛋白在-30~0℃与20~95℃的温度条件下的热力学性质。结果表明,虽然胡杨CBL1蛋白在应对低温环境胁迫中发挥作用,但是胡杨CBL1蛋白本身并不具有抗冻性能,且其熔化过程中的冰晶含量与保留温度呈指数对应关系;而在加热过程中,胡杨CBL1蛋白在81.6℃左右不可逆变性,在变性之前胡杨CBL1蛋白的熵与焓增量逐渐减小,在变性之后熵与焓迅速增加,显示出胡杨CBL1蛋白具有较高的热稳定性。

沙冬青CBL1蛋白纯化及性质研究

CBL是近年来发现的一类钙信号转导蛋白,CBL-CIPK组成的信号通路在植物应答生物和非生物刺激中发挥重要作用。其中CBL1和相应的CIPK在低钾,渗透压,干旱,机械损伤,及冻伤等环境胁迫中发挥重要作用。通过对沙冬青CBL1表面带电氨基酸定点突变,表面赖氨酸甲基化后电荷消除证明了沙冬青CBL1(AmCBL1)在钙离子存在下的非特异性聚集是由于分子间的电荷相互作用引起,三体蛋白很可能是沙冬青CBL1蛋白发挥功能的单位。通过甲基化可以得到聚合状态均一的蛋白,为CBL1晶体生长奠定了基础。

铁皮石斛CIPK24与CBL1的互作及盐胁迫下的表达分析

为研究铁皮石斛(Dendrobium catenatum Lindl.)应对盐胁迫的抗性机制,利用PCR技术从铁皮石斛cDNA中克隆丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因CIPK24和类钙调素B亚基蛋白基因CBL1,用生物信息学技术对其编码蛋白的进化关系进行了分析;采用实时荧光定量PCR技术分析它们的表达模式;并构建酵母表达载体,利用酵母双杂交技术研究这两个蛋白的互作关系。结果表明,铁皮石斛CIPK24和CBL1分别与拟南芥CIPK24以及CBL1蛋白的亲缘关系最近;空间表达模式分析发现CIPK24和CBL1基因在花萼、合蕊柱等生殖器官中表达量较高,而在营养器官中表达量较低;盐处理铁皮石斛组培苗后,CIPK24在根中受盐胁迫诱导上调表达,在茎和叶中表达量变化不明显;而CBL1基因在根和叶中受盐胁迫诱导均呈现上调表达,且根中CIPK24和CBL1基因的表达模式相似。酵母双杂交结果表明铁皮石斛CIPK24和CBL1蛋白能够互作。本研究表明,根中CIPK24和CBL1通过互作可能在铁皮石斛响应盐胁迫中起到重要作用,为进一步研究铁皮石斛耐盐性提供理论参考。

非生物逆境胁迫下甘蔗CBL1和CBL6基因表达分析

CBLs蛋白是植物一类特殊的Ca2+信号感受器,在植物遭受逆境胁迫过程中发挥重要的调节作用。文章利用NCBI数据库信息获得2个甘蔗CBL家族基因,分别为SsCBL1和SsCBL6。SsCBL1基因包含一个完整的642 bp的完整开放阅读框,编码213个氨基酸;SsCBL6基因包含一个完整的672 bp完整开放阅读框,编码223个氨基酸。通过生物信息学分析方法对SsCBL1和SsCBL6基因编码蛋白结构进行分析。结果显示两者均无跨膜结构域并且都包含4个EF-hand结构域。进化树分析显示SsCBL1和SsCBL6与其他植物的CBL1和CBL6亲缘关系较近,具有较高的保守性。实时荧光定量PCR检测结果发现,这两个基因在低氮、低磷、低钾、干旱、盐和ABA胁迫过程中其表达均发生变化。SsCBL1基因在干旱和盐胁迫过程中,表达量上调幅度较大,而SsCBL6基因在低钾、干旱和盐处理时表达量上调幅度大。实时定量分析结果表明SsCBL1和SsCBL6基因在多种胁迫下发挥重要的调控作用。

微信平台翻转课堂联合CBL教学法在心外科住院医师规范化培训中的应用

目的 探讨微信平台翻转课堂联合基于案例式学习(case-basedlearning,CBL)教学法在心外科住院医师规范化培训教学中的应用效果。方法 选取某三甲医院心外科2019年2月1日-2020年4月30日参与住院医师规范化培训118名学员为研究对象,根据心外科教学模式的不同分为对照组(n=58)和观察组(n=60)。对照组采用传统教学法,观察组采用微信平台翻转课堂联合CBL教学法。培训结束后进行客观知识考核和问卷课程满意度调查,比较2组教学效果。结果 观察组学员的临床技能操作和病例分析成绩均高于对照组(91.10±4.51分与83.21±5.44分和89.25±3.22分与81.40±2.85分),差异具有统计学意义;2组学员基础理论知识无统计学差异(87.35±2.59分与86.48±2.99分)。观察组在激发学习热情、锻炼临床思维等6个方面培训效果及总体教学模式的满意度(85.00%与63.79%)均高于对照组,差异具有统计学意义。结论 微信平台翻转课堂联合CBL教学法能有效提高心外科住院医师规范化培训的教学质量并提高教学满意度。