Toll样受体5激动剂CBLB502-Fc融合蛋白的表达纯化及初步鉴定

目的:构建Toll样受体5激动剂CBLB502-Fc融合蛋白的真核表达载体,并在CHO细胞中表达,纯化得到具有生物学活性的目的蛋白。方法:首先从合成的pUC57-CBLB502质粒中扩增出CBLB502基因片段,酶切后克隆至pUC57-Fc质粒中,然后双酶切pc DNA3.1和pUC57-CBLB502-Fc,将CBLB502-Fc基因片段克隆至载体pc DNA3.1,挑选阳性克隆并测序,再将重组质粒转染CHO细胞,筛选高表达细胞系,用免疫印迹鉴定表达情况,Protein A亲和柱纯化目的蛋白,SDS-PAGE鉴定目的蛋白,用小鼠辐射试验初步验证目的蛋白的生物学活性。结果:构建了pc DNA3.1-CBLB502-Fc真核表达载体;转染CHO细胞,筛选得到CBLB502-Fc高表达细胞系,并经免疫印迹鉴定培养上清;纯化得到较高纯度的融合蛋白并经SDS-PAGE鉴定;小鼠辐射实验表明CBLB502-Fc具有抗辐射作用。结论:真核表达并纯化了具有抗辐射作用CBLB502-Fc融合蛋白,为后续研究CBLB502-Fc的生物学功能奠定了重要基础。

TLR5信号通路对肝脏免疫状态的影响

目的探讨TLR5信号通路对肝脏免疫微环境的调控作用。方法检测外源性TLR5信号活化时(C57BL/6小鼠注射TLR5激动剂CBLB502蛋白)和内源性tlr5基因缺失(tlr5-/-)时小鼠外周血象的变化、血清转氨酶的水平、肝内趋化因子mRNA的水平及肝内免疫细胞的比例。结果 TLR5信号活化后外周血白细胞、中性粒细胞数目显著上升,淋巴细胞、红细胞、血红蛋白和血小板数目显著下降;肝内中性粒细胞、巨噬细胞、树突细胞和自然杀伤细胞的比例显著增加,血清转氨酶水平未见升高;肝内CCL2、CCL7、CXCL1和ICAM-1 m RNA水平均显著上调。与野生型相比,tlr5-/-小鼠外周血中性粒细胞数目显著增加,血小板数目显著降低;肝内中性粒和树突细胞比例显著增加,CD4+T细胞的活化增强,血清转氨酶水平略有升高,肝组织病理分析未见异常;肝内CCL2、CCL3、CXCL1、IL-1β、TNF-α和IFN-γmRNA水平显著上调。结论 TLR5信号通路对肝脏免疫状态具有调控作用,对其功能的合理调节有利于肝脏炎性疾病的防治。

CBLB502蛋白原核表达及辐射防护作用验证

目的原核表达并纯化TLR5受体的激动剂CBLB502蛋白，验证其辐射防护作用。方法采用pET28b原核表达系统表达CBLB502蛋白，利用Ni-NTA亲和层析柱亲和层析纯化CBLB502蛋白，经报告基因检测方法结合动物实验评价纯化蛋白活性。结果成功表达并纯化CBLB502蛋白，纯度可达95％以上，能够激活NF—κB报告基因，可以提高9Gy照射小鼠存活率，对照组小鼠全部死亡，CBLB502蛋白预防组全部存活。结论成功表达并纯化CBLB502蛋白，并验证其对小鼠的辐射防护作用。