GST-CBX2-1融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

目的:构建GST标签的CBX2-1融合蛋白表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达,纯化出表达蛋白。方法:以CBX2-1全长为模板,构建3对引物,将CBX2-1PCR扩增成3段,通过XhoⅠ和NotⅠ酶切位点将其定向插入p GEX-4T-3载体中,并转化E.coli DH5ɑ,通过限制性内切酶酶切电泳和DNA测序坚定正确后,转入E.coli BL21中,经IPTG大量诱导表达,SDSPAGE电泳和Western blot鉴定,运用GST pull down方法纯化3段蛋白。结果:酶切电泳及测序结果证明,原核表达质粒GST-CBX2-1 3个载体构建成功,用Western blot方法证实了GST-CBX2-1-1(1-288),GST-CBX2-1-2(259-600),GST-CBX2-1-3(601-1596)融合蛋白的表达,并成功纯化出3段蛋白。结论:成功构建了GST-CBX2-1-1,GST-CBX2-1-2,GST-CBX2-1-3原核表达载体,证实了其在原核细胞大肠埃希菌中的表达与纯化,为进一步研究CBX2-1各结构域的功能提供了前提基础。

CBX2-1与p53相互作用的机制

目的:检测CBX2-1与p53是否存在相互作用,并一步检测CBX2-1与p53发生相互作用的结构域。方法:在大肠杆菌中表达GST-CBX2-1融合蛋白,GST pull down纯化出蛋白与细胞裂解液混合,Western blot检测两个蛋白相互作用。同样的方法进一步检测CBX2-1与p53发生相互作用的结构域。结果:Western blot结果显示CBX2-1与p53存在直接相互作用,相互作用的结构域是CBX2-1蛋白N端1-288肽段和259-600肽段及p53蛋白的98-292肽段。结论:CBX2-1蛋白通过N端1-288肽段和259-600肽段与p53蛋白98-292肽段相互作用,为进一步研究研究CBX2-1参与神经性列腺癌的机制提供了一定的理论基础。