柿果实CCD1基因超表达和RNAi表达载体的构建

采用CTAB法提取小方柿果肉总RNA,根据带有不同酶切位点的引物获得目的基因柿类胡萝卜素裂解双加氧酶基因(DkCCD1),将扩增的目的基因序列与NCBI登录的基因序列进行核苷酸序列和氨基酸序列比对,发现核苷酸序列相似度均超过99%,氨基酸序列相似度均为100%,由此得到可用于后续试验的目的基因。将得到的目的基因与双元表达载体pCAMBIA1301连接,构建pCAMBIA1301-CCD1超表达载体和具有发卡结构的pCAMBIA1301-CCD1-RNAi表达载体,通过冻融法将载体导入农杆菌EHA105。PCR扩增结果表明:所构建的pCAMBIA1301-CCD1超表达载体和pCAMBIA1301-CCD1-RNAi载体已导入农杆菌,可用于后续的遗传转化研究。

北美鹅掌楸CCD1基因的克隆与表达分析

本研究以北美鹅掌楸为试验材料,从北美鹅掌楸和鹅掌楸转录组数据库中挖掘出37条CCD基因家族的EST序列,并将这些序列归类于CCD基因家族中。以其中一条预测为CCD1的EST序列为基准设计引物,通过反转录PCR(RT-PCR)与c DNA末端快速扩增(RACE)技术从北美鹅掌楸中克隆得到一条全长为1 929 bp的序列,命名为LtCCD1基因。该基因包含102 bp 5'端、177 bp 3'端非翻译区序列和1 650 bp的开放阅读框,共编码549aa。LtCCD1基因与多个物种CCD1基因相似度大于80%,其编码的蛋白质拥有CCD基因家族典型的结构域RPE65。系统发育分析发现,LtCCD1基因编码的蛋白质与Anthurium amnicola、Crocus ancyrensis和番红花的CCD1基因编码的蛋白质亲缘关系较近。LtCCD1蛋白质分子量为61.96 kD,等电点为6.10,属酸性蛋白;无规则卷曲是该蛋白质二级结构的主要成分。利用在线软件Target P进行亚细胞定位预测并结合CCD1蛋白在其它植物中的定位信息,推测该蛋白可能位于细胞质内。使用实时荧光定量PCR技术对该基因进行组织特异性表达分析,发现LtCCD1基因在北美鹅掌楸的花瓣、花萼、雄蕊、雌蕊、花芽、叶、叶芽、茎8个组织中均有表达,表达量从大到小的顺序依次为:叶、花萼、花瓣、茎、雌蕊、叶芽、花芽、雄蕊。该研究结果可为进一步分析北美鹅掌楸中CCD1基因的功能奠定基础。

GST-Ccd1融合蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

目的:利用大肠杆菌DH5α表达GST—Ccd1融合蛋白,并用亲和层析分离纯化,进行动物免疫制备多克隆抗体。方法:利用本室构建好的pGEX-5X-1-Ccd1-N原核表达重组质粒,转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导表达,在大肠杆菌表达系统中获得可溶性表达。经谷胱甘肽Sepharose 4B介质填充的层析柱分离纯化蛋白,制备抗原免疫动物,得到Ccd1的兔源多克隆抗体。结果:ELISA结果显示血清抗体效价可以达到1∶40 000。免疫组化分析表明自制的抗体能特异性与Ccd1蛋白相互作用,可以用于实验分析。结论:制备了效价高特异性良好的抗Ccd1多克隆抗体,经实验验证获得的抗体能够满足针对Ccd1的免疫印迹和免疫组化检测的实验要求,为今后深入研究Ccd1表达的组织分布、细胞内定位及其生物学功能提供了有用的实验工具。