CCK39／UreB双基因融合表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

本研究报道了猪源性胆囊收缩素39肽(Cholecystokinin 39,CCK39)和猪肠道大肠菌群脲酶B亚基(Urease B,UreB)融合的原核表达载体的构建,以及兼有CCK39和UreB功能活性域的融合蛋白的表达。利用RT-PCR从猪十二指肠总RNA中克隆CCK39,再通过PCR从猪肠道产脲酶大肠菌群质粒中克隆UreB,之后将扩增所得的两基因先后定向插入原核表达载体pET43a(+)中,构建双基因融合表达载体pET43a(+)/CCK39/UreB,并转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL-21(DE3)中。重组质粒pET43a(+)/CCK39/UreB经PCR、双酶切鉴定和序列分析,证实已成功构建双基因融合表达载体。重组表达菌经isopropylthio-β-D-galactoside(IPTG)诱导表达了分子量约为80kD的融合蛋白,与预期分子量相同,主要以可溶蛋白的形式存在于细胞质中;用Ni2+-NTA对可溶蛋白进行亲和纯化,纯度大于95%;Western blotting分析结果显示重组融合蛋白可分别为CCK8和UreB抗血清识别,具有良好的反应原性。本研究所表达的融合蛋白为研制抗CCK/Urease双效疫苗奠定了基础。

抗重组猪三十九肽胆囊收缩素卵黄抗体的制备

制备重组猪三十九肽胆囊收缩素(GST-CCK39),以其为抗原免疫28周龄的蛋鸡,用水稀释脱脂处理,聚乙二醇(PEG)一步法制备高效价卵黄抗体,并用免疫琼脂扩散试验、ELISA、Dot-ELISA检测其效价及特异性。结果表明,免疫琼脂扩散测得特异性抗体效价达1∶16以上,ELISA效价达1∶12 800以上;Dot-ELISA显示所获得卵黄抗体具有较强的特异性;高效价,特异性的卵黄抗体可维持50 d以上。表明用重组蛋白GST-CCK39免疫蛋鸡后能获得效价高、特异性强的卵黄抗体。