幽门螺杆菌融合蛋白HspA-UreB在大肠杆菌中的表达与鉴定

目的在大肠杆菌中表达幽门螺杆菌(简称Hp)HspA-UreB融合蛋白,并探索其免疫反应性,为Hp基因工程疫苗的研制奠定基础。方法用PCR方法扩增郑州分离Hp菌株MEL-HP27的hspA和ureB基因,分别克隆入pNEB193中。测序后,回收两种基因片段,并以hspA-ureB的顺序连接插入原核表达载体pMAL-C2x进行融合表达。采用蛋白印迹法对表达产物进行鉴定。结果特异PCR法和酶切鉴定证实融合基因hspA-ureB克隆入表达载体中;重组质粒转化大肠杆菌TB1后,经IPTG诱导3h,SDS-PAGE电泳显示在119kDa处出现一条特异蛋白带,即麦芽糖结合蛋白(MBP)与HspA-UreB的融合表达形式,约占细菌总体蛋白含量的31%;该融合蛋白与Hp免疫小鼠血清和Hp阳性病人血清的Westernblot分析结果显示,在119kDa处出现特异杂交带。结论成功地在大肠杆菌中实现了Hp融合蛋白HspA-UreB的高效表达,并证实其具有良好的免疫反应性。

CCK39／UreB双基因融合表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

本研究报道了猪源性胆囊收缩素39肽(Cholecystokinin 39,CCK39)和猪肠道大肠菌群脲酶B亚基(Urease B,UreB)融合的原核表达载体的构建,以及兼有CCK39和UreB功能活性域的融合蛋白的表达。利用RT-PCR从猪十二指肠总RNA中克隆CCK39,再通过PCR从猪肠道产脲酶大肠菌群质粒中克隆UreB,之后将扩增所得的两基因先后定向插入原核表达载体pET43a(+)中,构建双基因融合表达载体pET43a(+)/CCK39/UreB,并转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL-21(DE3)中。重组质粒pET43a(+)/CCK39/UreB经PCR、双酶切鉴定和序列分析,证实已成功构建双基因融合表达载体。重组表达菌经isopropylthio-β-D-galactoside(IPTG)诱导表达了分子量约为80kD的融合蛋白,与预期分子量相同,主要以可溶蛋白的形式存在于细胞质中;用Ni2+-NTA对可溶蛋白进行亲和纯化,纯度大于95%;Western blotting分析结果显示重组融合蛋白可分别为CCK8和UreB抗血清识别,具有良好的反应原性。本研究所表达的融合蛋白为研制抗CCK/Urease双效疫苗奠定了基础。

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位在大肠杆菌中的融合表达与鉴定

目的 通过对幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hipylori)尿素酶B亚单位在大肠杆菌中表达的研究,探索其免疫反应性。方法 用高保真PCR方法扩增H.pylori ureB基因,并定向克隆入pNEB193中,然后经酶切回收后插入原核表达载体pMAL-C2X进行融合表达。采用蛋白印迹法对表达产物进行鉴定。结果 特异PCR和酶切鉴定证实融合基因ureB克隆入表达载体,SDS-PAGE结果显示ureB在大肠杆菌中以融合蛋白形式MBP-ureB高效表达,约占细胞总蛋白量的26.7％。该融合蛋白可与H.pylori阳性病人血清发生特异反应。结论 成功构建了能高效表达H.pylori ureB的重组菌,为Hp基因工程疫苗的进一步研究奠定了基础。