CCR5 gene expression in fulminant hepatitis and DTH in mice

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多靶点沉默CCR5基因载体构建及沉默效果验证

目的筛选沉默CCR5基因的靶点并验证多靶点沉默CCR5基因的效果。方法检索人CCR5基因的cDNA序列,设计针对CCR5 mRNA的siRNA,选择与靶基因结合具有高特异性的3个siRNA序列,合成shRNA双链,构建多靶点沉默CCR5重组质粒。同时合成CCR5过表达质粒。经测序验证后进行质粒慢病毒包装。首先,用CCR5过表达慢病毒转染Jurkat T细胞,实时荧光逆转录定量聚合酶链反应(real-time reverse transcription quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测CCR5过表达情况。Control组(空白对照)为Jurkat T细胞,将CCR5过表达细胞分组为CCR5-OE组(CCR5过表达)、CCR5-OE-NC组(CCR5过表达阴性对照)、CCR5-OE-沉默组(CCR5过表达沉默)。RT-qPCR和Western bolt检测CCR5沉默重组质粒对目的基因的沉默效果。实验中各项数据的分析选用SPSS软件,作图选用GraphPad Prism软件。结果测序结果证明,CCR5过表达质粒含有目的序列,CCR5沉默重组质粒中含有3个目的靶点序列。RT-qPCR检测CCR5过表达情况显示,细胞CCR5的基因表达显著升高,可进行后续实验。CCR5沉默慢病毒感染后,RT-qPCR和Western bolt检测各组CCR5表达结果显示,多靶点CCR5沉默组的CCR5基因表达水平和蛋白表达水平较CCR5-OE组降低(P均<0.05)。结论成功构建多靶点沉默CCR5基因重组质粒,验证多靶点沉默CCR5基因的有效性,为基因编辑治疗艾滋病提供实验数据。

应用TALEN技术对兔CCR5基因进行靶向修饰

缺少合适的能够被人免疫缺陷病毒1型（Human immunodeficiency virus 1,HIV-1）感染的动物模型是获得性免疫缺陷综合征/艾滋病（Acquired immunedeficiency syndrome,AIDS）疫苗和药物研发的瓶颈.HIV-1能在野生型兔子中形成持续感染,在共表达人CD4和CCR5的兔细胞系中,HIV-1能高效复制,并形成合胞体.若在家兔中高表达人CD4和CCR5,就可能获得研究AIDS的理想动物模型.文章采用高效基因打靶技术—类转录激活因子效应物核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease,TALEN）,探讨在家兔CCR5基因位点定点敲入人CD4和CCR5,获得能够感染HIV-1家兔模型的可能性.针对家兔CCR5基因,设计了两对TALENs和一个同源打靶载体,TALEN mRNAs和DNA同源片段显微注射到家兔受精卵中,体外培养3～5 d后,收集24枚胚胎,对胚胎的基因突变情况进行PCR和测序分析.结果显示,在家兔CCR5位点,24枚胚胎均发生了基因敲除,5枚胚胎还发生了人CD4和CCR5基因敲入.该结果为建立艾滋病研究新动物模型奠定了基础.

中国人CCR5732基因突变的检测及其对HIV遗传易感性的初步评估

为了解ＣＣＲ５Δ３２ 基因突变在中国本土人群基因组中的分布，初步评估我国人群对ＨＩＶ－１ 感染的遗传易感性，用ＰＣＲ扩增、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交和ＤＮＡ 测序等分子生物学方法对９１５ 名中国人来源的基因组ＤＮＡ中ＣＣＲ５Δ３２ 基因突变进行了检测。结果发现，所有被检测的个体绝大多数均表现为ＣＣＲ５ ｗ ｔ／ｗ ｔ纯合子等位基因型，仅检测到两例个体为突变的杂合子ＣＣＲ５ｗ ｔ／Δ３２ 基因型，而未见到有突变的ＣＣＲ５Δ３２／Δ３２ 纯合子的个体。上述初步结果提示：在我国人群中，ＣＣＲ５Δ３２ 基因突变率很低（约为０．２％ ），所以我国绝大多数人群对ＮＳＩ嗜巨噬细胞的ＨＩＶ－１

CCL5/CCR5基因启动子多态性与糖尿病性微血管并发症的相关性评估

目的更准确地评估趋化因子配体5(CCL5)/趋化因子受体5(CCR5)基因启动子多态性与糖尿病性微血管并发症(DMI)之间的关联。方法通过PubMed、Embase、Medline、中国国家知识基础设施、Web of Science和Cochrane数据库检索相关研究文献。应用合并的优势比(OR)和95%置信区间(CI)描述CCL5-403 G/A、CCL5-28 C/G、CCR5-59029 G/A与DMI关联的强度。结果数据包括2737例DMI患者和2435例糖尿病对照受试者。CCL5-403 G/A和CCL5-28 C/G多态性与DMI风险没有显著相关。在显性模型中,CCR5-59029 G/A是DMI的独立危险因素(OR为1.77;95%CI为1.06,2.97)。亚洲人出现CCR5-59029A阳性基因型的风险显著(OR为2.08;95%CI为1.68,2.57)。此外,CCR5-59029A阳性基因型与白蛋白尿风险增加相关(微量白蛋白尿OR为1.68;95%CI为1.15,2.44;大量蛋白尿OR为2.70;95%CI为1.07,6.83)。结论CCL5基因启动子多态性与DMI的风险没有关联。但是,CCR5-59029A多态性会影响个体对DMI的敏感性。

CCR5基因启动子多态性与2型糖尿病肾病相关性研究

目的探讨趋化因子受体5(CCR5)基因启动子多态性与中国人2型糖尿病肾病之间的关系。方法应用聚合酶链反应限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP),检测2型糖尿病患者、2型糖尿病合并肾病患者及正常对照组CCR5基因启动子59029G/A基因型,并对各组间的等位基因频率与基因型频率进行比较。结果A(+)基因型:单纯糖尿病组(DNO)与糖尿病肾病微量白蛋白尿组(DN1)比较差异有显著性(P=0.310),与大量白蛋白尿组(DN2)比较差异有显著性(P<0.01),DN1组与DN2组比较差异有显著性(P=0.002),DNO组与糖尿病肾病组(DN1+DN2)比较差异有显著性(P=0.007)。结论CCR5 59029G/A基因多态性与糖尿病肾病的发展密切相关。

生殖细胞基因编辑与基因治疗的问题与展望——以CCR5基因为例

医学科学研究和医学临床实践,需要遵守人类的国际准则和国家的具体法规。最近报道的基因编辑婴儿,是一起破坏人类医学伦理底线的非法行医事件的结果。本文以CCR5基因为例,探讨基于基因编辑或基因治疗受精卵的技术局限性和未来需要发展的技术路径。

CCR5基因编码区894C缺失突变在中国人群中的发现

目的 调查中国汉族人HIV协同受体CCR5编码区基因突变和SNP特点。方法PCR扩增CCR5编码区,PCR产物直接进行基因测定。结果 在50例标本中,发现一例CCR5X编码区894ΔC杂合子;采用反向经物进行验证,确定测序结果准确无误。该人缺失引起移码突变,使CCR5C端减少了44个氨基酸。结论 中国汉族人群中存在CCR5 894ΔC,该突变能导致CCR5受体结构和功能改变。

CCR5基因5′侧翼区的克隆及调控功能初步研究

目的 :研究CCR5基因 5′侧翼区的调控序列。方法 :分段构建CCR5基因 5′侧翼区的pCAT报告基因载体 ;分析各片段在Hela细胞中的CAT调节活性。结果 :CCR5基因 5′侧翼区基因 - 1～ - 4 86bp序列的pCAT重组质粒在Hela细胞中能明显表现CAT上调活性 ,其活性比pCATenhancervector的活性高 3倍。结论 :CCR5基因 5′侧翼区基因 - 1～ - 4

CCR2和CCR5基因多态性与结核性脓胸的关系

目的探讨CCR2基因-190 G/A和CCR5基因-59029 G/A单核苷酸多态性(SNP)与结核性脓胸的关系。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法对结核性脓胸患者300例和健康对照组300例进行CCR2基因-190 G/A和CCR5基因-59029 G/A SNPs检测。结果与CCR2基因-190 GG基因型相比,携带AG和AA基因型均可增加结核性脓胸发病风险(OR=2.254,95%CI 1.043~4.868;OR=8.728,95%CI 4.224~18.033)。进行分层分析发现,无卡介苗(BCG)接种史、体质量指数(BMI)<18.5 kg/m^2均增加结核性脓胸发病风险(OR=3.309,95%CI 2.108~4.382;OR=2.767,95%CI 1.918~3.993)。CCR5基因-59029 G/A各基因型未入选回归方程,无统计学意义(P>0.05)。结论CCR2基因-190 G/A SNP可能与结核性脓胸的发病风险有关;CCR5基因-59029 G/A SNP可能与结核性脓胸无关。

CCR5基因多态性与尖锐湿疣的关系

目的探讨CCR5△32基因多态性与尖锐湿疣的关系。方法收集60例尖锐湿疣患者和50例健康对照者的DNA标本,采用PCR方法扩增CCR5基因片段,比较两组的基因型差别。结果60例尖锐湿疣和50例健康对照者中均未发现突变型CCR5△32基因型。结论CCR5△32基因多态性与尖锐湿疣无相关性。

PCR-RFLP方法检测CCR5基因启动子区59029G/A多态性的实验研究

目的:确定PCR-RFLP技术检测CCR5基因启动子区59029G/A多态性的最适实验条件.方法:对主要影响因素设系列浓度梯度分别进行PCR后观察电泳结果.结果:最适变性温度为94℃;最适退火温度为60℃;最适引物浓度为0.4μmol/L;最适Mg2+浓度为1.5 mmol/L;最适dNTP浓度为0.20 mmol/L;以1.0 U为最适Taq酶量.结论:酶切体系为20μL体系中加5μL产物用4 U的酶消化,为后续研究奠定了实验基础.

RANTES及其受体CCR5与糖尿病的相关研究

糖尿病是当前威胁人类健康最主要的非传染性疾病之一.研究发现:趋化因子不仅参与糖尿病的发病,而且与糖尿病并发症的发生发展也密切相关.C-C亚族趋化因子目前已成为炎症性疾病发病机制的研究热点之一.调节激活正常T细胞表达和分泌的细胞因子(regulate upon activation normal T cell expressed and secreted,RANTES)属于C-C亚族趋化因子的成员.就RANTES及其受体CCR5(CC-chemokine receptor)与糖尿病的关系作一综述.

人CCR5基因真核表达质粒的构建及其鉴定

目的:构建人CCR5基因的真核表达质粒并对其进行功能鉴定。方法:PCR扩增人CCR5基因,将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1内,构建含人CCR5基因的真核表达质粒pcDNA3.1-CCR5。使用RT-PCR、流式细胞术和HIV假病毒感染实验的方法,鉴定CCR5在真核细胞中的表达和功能。结果:克隆的人CCR5基因与GenBank中已登记的基因序列100%同源。瞬时转染真核细胞后,RT-PCR在预期的位置检测出目的条带,流式细胞术检测到约25.6%的细胞表达CCR5蛋白,且该蛋白能介导HIV假病毒的感染。结论:成功构建了含人CCR5基因的真核表达质粒。

通过编辑人类胚胎CCR5基因预防艾滋病事件的反思

基因治疗虽已有较长的发展历史,当前已发展到基因编辑阶段。但是无论从国际上还是我国的探索都显示基因编辑在安全性和有效性方面还没有得到充分的证明,特别是编辑CCR5基因预防艾滋病就目前研究表明还存在技术风险。基因编辑对于遗传病基因治疗是很有价值的,反思基因编辑预防艾滋病临床应用这一突破伦理与法律底线的事件,建议重大新技术的临床应用,需要在国家层面进行广泛听证,接受国家层面的严格监督,并进行大量的临床前试验和各方面安全性、有效性评估后方可实施。

中国荷斯坦奶牛CCR5基因克隆、生物信息学及表达分析

试验旨在克隆中国荷斯坦奶牛CC趋化因子受体5(C-C chemokine receptor type 5,CCR5)基因,对其进行生物信息学分析,并探究CCR5基因在奶牛炎性和健康组织中的表达水平。采用PCR技术扩增并克隆荷斯坦奶牛CCR5基因CDS区全长序列,连接pMD18-T载体并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,通过蓝白斑方法筛选阳性克隆并测序,对序列进行相似性比对及系统进化树构建;应用多种在线生物信息学软件对其编码蛋白进行分析,并利用实时荧光定量PCR方法检测CCR5基因在健康和炎症奶牛乳腺组织中的表达情况。结果显示,中国荷斯坦奶牛CCR5基因CDS区全长1059 bp,编码352个氨基酸。相似性和遗传进化分析结果显示,奶牛CCR5基因与绵羊的遗传距离最近,高达96.0%,与鸡遗传关系最远,为61.0%,且在不同物种之间CCR5基因高度保守。中国荷斯坦奶牛CCR5蛋白分子质量为40.235 ku,理论等电点(pI)为9.30,为疏水性蛋白但不是分泌蛋白,主要存在于细胞质内;在CCR5蛋白二级结构中α-螺旋和无规则卷曲分别占51.14%和32.95%,三级结构模型预测结果与二级结构一致。实时荧光定量PCR结果显示,CCR5基因在健康奶牛乳腺组织中的表达量极显著低于炎性奶牛乳腺组织(P<0.01),提示其可能参与奶牛乳腺炎的发生过程。本试验结果为进一步研究奶牛CCR5蛋白的功能提供了理论依据,对探究奶牛CCR5基因在奶牛乳腺炎中的调控功能等具有重要意义。

广西仫佬、壮和汉三民族HIV辅助受体CCR5基因多态性研究

目的了解广西仫佬、壮和汉三民族人群中HIV辅助受体CCR5△32和CCR5-894C缺失等位基因突变频率和多态性的特点,为评估这三个民族人群对HIV的遗传易感性和艾滋病的防治提供理论依据。方法以197例仫佬族,100例壮族和100例汉族为研究对象,应用PCR和DNA测序等方法检测CCR5△32和CCR5-894C缺失突变体。结果未发现CCR5△32和CCR5-894C缺失突变体,均为野生型。结论由于未发现CCR5△32和CCR5-894C缺失突变体,推测广西仫佬、壮和汉三民族人群对HIV-1病毒感染可能具有较大的遗传易感性。

中国汉族人HIV辅助受体CCR5编码区新SNP位点研究

目的普查中国汉族人群HIV-1协同受体CCR5编码区的基因多态性位点,为中国的艾滋病防治提供依据。方法 CCR5编码区用2对引物进行PCR扩增,设计测序引物依次测序,样本数为45例,用DNAstar分析测序结果,寻找SNP位点。结果在编码区共发现6个SNP位点,4个引起氨基酸改变:A184G、G503T、G668A、G999T;一个单碱基缺失,引起移码突变和提前终止。A184G、G503T、G999T三个中国汉族人所特有的SNP位点为首次发现,等位基因频率分别为1％,39.5％和9.5％;其中G503T分布明显不符合Hardy-Wein-berg平衡。G668A和894C缺失曾在中国和日本人群中发现过,但我们的结果与所报道的基因频率不完全一致。结论中国汉族人CCR5编码区SNP位点有自己的特点,与高加索人和非洲人明显不同,与日本人也不完全一致。我们共找到5个引起氨基酸改变的突变或SNP位点,其中3个为首次发现。这些SNP对于HIV-1感染和艾滋病病程的影响值得进一步研究。

人工繁育恒河猴CCR5全基因突变特征及其与人和部分非人灵长类动物的异同

目的:研究人工繁育恒河猴趋化因子受体5(CCR5)全基因突变特征及其与人和部分非人灵长类动物的异同。方法:对82只人工繁育恒河猴CCR5进行全基因测序,分析CCR5全基因序列中的突变位点及突变类型;使用DNASTAR、MEGA、Dna SP软件分析其与人及黑猩猩、猩猩、恒河猴、大猩猩和非洲绿猴其他非人灵长类动物的异同。结果:恒河猴群CCR5全基因序列中共存在8个突变位点,均为同义突变;恒河猴与人类CCR5基因DNA序列有31个位置上存在碱基差异,8个位置的编码氨基酸不同,3个突变位点与人CCR5基因突变情况相同;在与人类及非人灵长类动物中的CCR5基因序列比较中,DNA序列共有44个位点存在差异,氨基酸序列共有14个位点存在差异,非人灵长类动物CCR5基因均未发现Δ32缺失。结论:人工繁育恒河猴群CCR5基因突变具有与其他非人灵长类及人类不同的特异分布特征。

贵州3个世居少数民族CCR5基因Δ32多态分布

目的调查贵州3个世居少数民族人群(苗族、布依族、水族)中趋化因子受体5(CCR5)基因Δ32位点多态性分布情况。方法采用PCR法直接扩增120例男性样本(雷山苗族27例、荔波布依族70例、荔波水族23例)的CCR5Δ32等位基因,分析PCR扩增产物并对产物进行测序验证。结果 3个世居少数民族人群中只发现了169 bp片段的野生型基因型,CCR5Δ32等位基因突变频率为0。结论贵州3个世居少数民族人群CCR5Δ32等位基因突变频率较低,可能对人类免疫缺陷性病毒(HIV-1)易感。