细胞内表达CCR5Delta32蛋白对HIV-1感染抑制作用的研究

人CCR5Delta32突变个体能有效抵制HIV-1感染,主要是由于该个体淋巴细胞内表达的CCR5Delta32突变蛋白能通过反式显性失活效应(TDN)抑制细胞表面HIV-1辅受体CCR5和CXCR4的产生.通过构建CCR5Delta32慢病毒载体,体外转染人外周血单个核细胞(PBMCs),研究细胞内表达CCR5Delta32蛋白对HIV-1感染的抑制作用.结果表明,表达CCR5Delta32蛋白的人PBMCs对HIV-1R5、X4及R5X4毒株感染均具有显著的抑制作用.这些工作为后续的AIDS基因治疗研究奠定了基础.

人CCR5Delta32基因的克隆及其重组慢病毒载体的构建

目的:克隆人CCR5Delta32基因并构建含目的基因的重组慢病毒载体pLenti-CCR5Delta32,用于获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的基因治疗研究.方法:从CCR5Delta32突变个体外周血单个核细胞(PBMCs)内提取人基因组DNA,利用PCR技术扩增CCR5Delta32全长基因,经EcoRI单酶切后与pUCm-T载体连接,随后转化感受态E.coli DH5α,提取质粒进行酶切鉴定及DNA测序.再将鉴定正确的CCR5Delta32基因亚克隆至慢病毒载体pLenti6/V5-D-TOPO并进行酶切鉴定及DNA序列分析.结果:经PCR扩增获得约650bp的DNA片段,测序结果与GenBank上的序列完全一致,克隆的目的基因已经正确插入到慢病毒载体pLenti6/V5-D-TOPO中.结论:成功克隆了人CCR5Delta32基因并构建了含目的基因的重组慢病毒载体pLenti-CCR5Delta32,为进一步AIDS基因治疗研究奠定基础.

含人CCR5Delta32基因重组慢病毒的包装及滴度测定

目的:包装含人CCR5Delta32基因的重组慢病毒并测定其滴度,用于获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的基因治疗研究。方法:从CCR5Delta32突变个体外周血单个核细胞(PBMC)中提取人基因组DNA,利用PCR技术扩增CCR5Delta32全长基因,经EcoRⅠ单酶切后与pUCm-T载体连接,随后转化E.coli DH5α,提取质粒进行酶切鉴定及DNA测序;将鉴定正确的CCR5Delta32基因亚克隆至慢病毒载体pLenti6/V5-D-TOPO并进行酶切鉴定及DNA序列分析;用pLP1、pLP2、pLP/VSVG及pLenti-CCR5Delta32等4种质粒共转染293T细胞,产生重组慢病毒并测定其滴度。结果:克隆出人CCR5Delta32基因,并构建了含该基因的重组慢病毒载体,经293T细胞包装后产生5×105 TU/mL的重组慢病毒。结论:高滴度含人CCR5Delta32基因重组慢病毒的包装,为进一步的AIDS基因治疗研究奠定了基础。

表达CCR5Delta32基因对人外周血单核细胞增殖功能的影响

目的:在人外周血单核细胞(PBMC)内表达CCR5Delta32基因,研究是否对该细胞增殖功能产生影响。方法:构建pLenti-CCR5Delta32慢病毒载体,包装后产生重组慢病毒,将其转染PBMC,荧光显微镜观察转染情况,Westernblot鉴定目的蛋白的表达;分别用植物血凝素(PHA)及破伤风类毒素(TTD)刺激培养经转染的靶细胞,采用MTT比色法测定其增殖功能是否受影响。结果:构建了pLenti-CCR5Delta32慢病毒载体,经包装后产生重组慢病毒,滴度约为5×105TU/mL。将其转染PBMC,观察到约半数PBMC胞浆内有绿色荧光蛋白表达,经Westernblot进一步鉴定为目的蛋白;转染的靶细胞经PHA或TTD刺激培养后,有着与正常PBMC相似的增殖功能。结论:构建了重组慢病毒并将其转染PBMC靶细胞,为获得性免疫缺陷综合征的基因治疗研究奠定了基础。

CCR5Delta32基因在人PBMC的表达及其对CCR5/CXCR4分子的影响

目的:在人外周血单个核细胞(PBMC)内表达CCR5Delta32蛋白,研究该蛋白与CCR5和CXCR4分子间是否存在相互作用。方法:构建pLenti-CCR5Delta32慢病毒载体,包装后产生重组慢病毒。将其转染PBMC,荧光显微镜观察转染情况,Western blot鉴定目的蛋白表达,免疫共沉淀检测目的蛋白与CCR5和CXCR4分子间的相互作用。结果:成功构建了pLenti-CCR5Delta32慢病毒载体,经包装后产生重组慢病毒,滴度约为5×108TU/L。将其转染PBMC,观察到约半数PBMC胞质内有绿色荧光蛋白表达,经Western blot鉴定有目的蛋白表达。免疫共沉淀结果显示,CCR5Delta32与CCR5、CCR5Delta32与CXCR4以异源二聚体形式结合,之间确实存在着相互作用。结论:成功地构建重组慢病毒载体并将其转染PBMC靶细胞,观察到目的蛋白与HIV-1两类辅受体(CCR5和CXCR4)间确实存在相互作用。这些工作为后续的AIDS基因治疗研究奠定了基础。

人PBMCs内表达CCR5Delta32蛋白对HIV-1辅受体抑制作用的研究

目的:在人PBMCs内表达CCR5Delta32蛋白,研究其对细胞表面HIV-1辅受体CCR5和CXCR4的抑制作用。方法:构建pLenti-CCR5Delta32慢病毒载体,包装后产生重组慢病毒。将其转染PBMCs,Western blot检测目的蛋白的表达。继续培养靶细胞,FACS分析细胞表面CCR5和CXCR4分子的变化。结果:成功构建了pLenti-CCR5Delta32慢病毒载体,包装后产生重组慢病毒。将其转染PBMCs,Western blot检测到目的蛋白的表达。FACS分析表明,靶细胞内目的蛋白的表达对靶细胞表面辅受体CCR5和CXCR4的产生起抑制作用,抑制率在转染后第6天达到高峰(CCR5的抑制率为51.69%,CXCR4的抑制率为61.05%)。结论:靶细胞内目的蛋白的成功表达及其对靶细胞表面HIV-1辅受体CCR5和CXCR4产生的抑制作用,为后续的AIDS基因治疗研究奠定了基础。

人CCR5Delta32基因重组慢病毒载体的构建及表达

目的:构建含人CCR5Delta32基因的重组慢病毒载体并鉴定其表达性能。方法:从CCR5Delta32突变个体外周血单个核细胞(PBMCs)内提取人基因组DNA,利用PCR技术扩增CCR5Delta32全长基因,经EcoRI单酶切后与pUCm-T载体连接,随后转化感受态E.coliDH5α,提取质粒进行酶切鉴定及DNA测序。再将鉴定正确的CCR5Delta32基因亚克隆至慢病毒载体pLenti6/V5-D-TOPO并进行酶切鉴定及DNA序列分析。最后用pLP1、pLP2、pLP/VSVG及pLenti-CCR5Delta32四种质粒共转染293T细胞,产生重组慢病毒并通过Western blot鉴定目的基因在靶细胞内的表达。结果:经PCR扩增获得约650bp的DNA片段,测序结果与发表于GenBank上的序列完全一致。经酶切鉴定,克隆的目的基因已经正确插入到慢病毒载体pLenti6/V5-D-TOPO中。四种质粒共转染293T细胞,产生出5×105TU/ml高滴度的重组慢病毒。用其感染靶细胞,Western blot结果显示有目的蛋白表达。结论:成功构建了含人CCR5Delta32基因的重组慢病毒载体并将其在293T细胞内表达,为进一步AIDS基因治疗研究奠定基础。