Science Letters:Assignment of CCR7 gene to chicken chromosome 27 by radiation hybrid panel mapping

The protein encoded by CC chemokine receptor 7 (CCR7) is a member of the G protein-coupled receptor family. This receptor was identified as a gene induced by the Epstein-Barr virus (EBV), and is thought to be a mediator of EBV effects on B lymphocytes. This receptor is expressed in various lymphoid tissues and activates B and T lymphocytes. It has been shown to control the migration of memory T cells to inflamed tissues, as well as stimulate dendritic cell maturation. To map the CCR7 gene in chicken chromosome, a 6 000 rads chicken-hamster radiation hybrid panel (ChickRH6) was used. PCR of samples from ChickRH6 revealed that the location of CCR7 gene is linked to the maker SEQ0347 (6 cR away) with LOD score of 16.6 and that the marker SEQ0347 is located on chromosome 27 at 27 cR of RH (radiation hydrid) map. We compared the corresponding human mRNA sequence with the predicted coding sequence of chicken CCR7 gene, and found that the assembled contig shared a high percentage of similarity with that of the human gene.

靶向CCR7基因shRNA表达载体的构建及鉴定

目的设计并构建靶向CCR7基因shRNA真核表达质粒,并检测其干扰效果。方法以CCR7为靶基因设计具有短发夹结构的模板寡核苷酸,退火形成互补双链结构,再克隆至pGC-silencer-CRM30载体,构建的3条重组短发夹shR-NA表达载体分别命名为pGC-silencer-CRM30-CCR7A、-CCR7B和-CCR7C。采用测序法鉴定寡核苷酸序列。将构建好的真核表达载体转染人结肠癌SW480细胞,荧光显微镜观察转染效果,RT-PCR法检测CCR7干扰效率。结果重组质粒测序结果与Genebank中的CCR7cDNA序列相符,转染SW480细胞后,荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白,RT-PCR结果表明,pGC-silencer-CRM30-CCR7C干扰效果最强。结论靶向CCR7基因shRNA表达载体构建无误,为进一步探讨趋化因子受体CCR7在胃肠道恶性肿瘤生物学行为中的作用奠定了基础。

miRNA靶向调控CCR7抑制结肠癌细胞增殖及侵袭的研究

目的探讨miRNA在调控趋化因子受体CCR7表达及对结肠癌细胞增殖及侵袭的影响。方法利用生物信息学网站Target Scan、Pietar和miRanda，综合文献寻找与CCR7基因相互作用的miRNA，综合3个数据库和文献的结果选取5条miRNA分别为miR—let7、miR-21、miR-98、miR-145、miR-642研究。使用PCR方法扩增含CCR7基因3’-UTR区序列插入到双酶切的双荧光素酶报告载体中，使用lipofectamine 2000转染试剂将报告载体和待筛选miRNA共转染293细胞，双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性。用迁移和transwell小室实验检测所预测的miRNA对结肠癌HCT116细胞转移和侵袭能力的影响。用Westernblotting检测miRNA作用于结肠癌HCTll6细胞后对CCR7蛋白表达的调控。结果得到含CCR7基因3’-UTR序列的双荧光素酶报告重组质粒，并用凝胶电泳和基因测序的方法验证。CCR7基因3’-UTR上有miRNA的调控作用靶点；双荧光素酶报告显示miR—let7、miR-21组比空白对照组CCR7基因3’-UTR双荧光素酶基因报告载体的荧光素酶活性下降。miR-let7、miR-21能显著抑制结肠癌HCTll6细胞迁移和侵袭能力，并且下调CCR7蛋白在HCT116细胞中的表达。结论CCR7基因3’-UTR段双荧光素酶基因报告载体构建成功，miRNA（miR—let7和miR-21）对CCR7有负调控作用。miR—let7和miR-21能抑制CCR7蛋白的表达，并抑制结肠癌细胞转移和侵袭能力。

牛源CCR7基因克隆、生物信息学及表达分析

【目的】探究CC趋化因子受体7(CC chemokine receptor 7,CCR7)基因编码蛋白的生物学特性及其mRNA在健康和炎性奶牛乳腺组织中的表达量。【方法】使用PCR扩增并克隆中国荷斯坦奶牛CCR7基因CDS区,测序后进行相似性比对及系统进化树构建;使用多种生物信息学软件分析CCR7蛋白的组成、理化性质及结构等;使用实时荧光定量PCR技术检测CCR7基因在健康和炎性奶牛乳腺组织中的表达差异。【结果】中国荷斯坦奶牛CCR7基因CDS区全长1325 bp,与绵羊的相似性较高(95.2%),亲缘关系较近;与鸡的相似性较低(56.4%),亲缘关系较远。CCR7基因编码379个氨基酸,其中亮氨酸含量最多,缬氨酸含量次之,组氨酸和色氨酸含量最低;CCR7蛋白分子质量为14.56 ku,理论等电点为8.89,平均亲水系数为0.640,是一种跨膜疏水性蛋白。CCR7蛋白信号肽切割位点可能存在于第24和25位氨基酸之间。CCR7蛋白二级结构中α-螺旋占比最大,高达51.72%,三级结构主要为α-螺旋和无规则卷曲。CCR7基因在炎性奶牛乳腺组织中的表达量极显著高于健康乳腺组织(P<0.01),其可能在奶牛乳腺炎的免疫调控中有着重要的作用。【结论】试验成功克隆出牛CCR7基因CDS区序列,并进行了相应的生物信息学分析及组织定量表达,为进一步研究CCR7基因的具体功能提供材料,对于探究CCR7基因在奶牛乳腺炎中的调控功能具有重要的意义。

CCR7重组慢病毒的构建及其表达对结肠癌细胞侵袭的影响

目的 构建含有 CCR7 的重组基因工程慢病毒，并转导结肠癌 HT29 细胞，高效表达CCR7 蛋白，并研究趋化因子受体 CCR7 的表达在人结肠癌 HT29 细胞体外转移中的作用。方法 提取HT29 细胞的 RNA，RT-PCR 扩增 CCR7 基因，克隆至慢病毒载体 pLVX-acGFP-N1，形成重组慢病毒载体 pLVX-acGFP-CCR7，转染 293T 细胞，得到慢病毒 LV-CCR7，转导慢病毒 LV-CCR7 至 HT29 细胞，经 puromycin 筛选 10 d。提取细胞的 RNA，QPCR 检测 CCR7 基因相对表达量的变化。划痕和 Transwell小室实验分别检测 HT29 细胞和 CCR7 过表达细胞迁移和侵袭能力的差异。Western blotting 检测 CCR7 蛋白和 MMP-9 蛋白相对表达量。结果 酶切和测序都表明 CCR7 克隆至慢病毒载体，慢病毒成功转导至HT29 细胞，QPCR 检测 HT29 细胞中 CCR7 表达升高了 15.4 倍，Western blotting 检测 CCR7 蛋白表达上升了 4.7 倍。CCR7 过表达的 HT29 细胞向划痕处爬行的速度明显快于 HT29 细胞对照组；过表达 CCR7 的HT29 细胞透过膜的数量高于普通 HT29 细胞。过表达 CCR7 的 HT29 细胞与细胞侵袭转移相关的基质金属蛋白酶表达量显著高于普通 HT29 细胞。结论 利用含有 CCR7 的重组基因工程慢病毒成功构建了高效表达 CCR7 蛋白的结肠癌 HT29 细胞。研究发现高效表达的 CCR7 能促进结肠癌 HT29 细胞的体外迁移侵袭能力，增强了基质金属蛋白酶的表达。

慢病毒载体介导CC趋化因子受体7基因过表达可促进大鼠骨髓间充质干细胞归巢

背景:研究发现,骨髓间充质干细胞特异性地表达CC趋化因子受体7(CC chemokine receptor,CCR7),与其配体次级淋巴组织趋化因子(secondary lymphoid-tissue chemokine,SLC)相互作用,有助于骨髓间充质干细胞归巢到损伤部位。目的:探讨CCR7基因过表达对大鼠骨髓间充质干细胞体内外归巢特性的影响。方法:利用慢病毒载体介导大鼠骨髓间充质干细胞过表达CCR7基因,建立过表达CCR7的骨髓间充质干细胞。通过Transwell实验体外检测趋化因子SLC对过表达CCR7的骨髓间充质干细胞体外定向迁移的影响。将SD大鼠分为4组,每组动物10只:①对照组:未接受全身照射大鼠作为对照组;②照射组:大鼠接受全身照射(60Co单次全身照射,总剂量为7.5 Gy,照射量率为0.75 Gy/min),输注生理盐水1 mL;③BMSCs-GFP组:大鼠经全身照射后,输注GFP标记的骨髓间充质干细胞悬液1 mL (含细胞5×105个);④CCR7-BMSCs-GFP组:大鼠经全身照射后,输注携带GFP和CCR7基因的骨髓间充质干细胞1 mL (含细胞5×105个)。移植24 h后取大鼠脾脏做冰冻切片,荧光显微镜下观察骨髓间充质干细胞归巢情况,流式细胞技术检测骨髓间充质干细胞在脾脏的归巢率。ELISA方法检测照射后大鼠外周血中SLC水平。结果与结论:①Transwell实验结果表明,过表达CCR7可促进骨髓间充质干细胞向趋化因子SLC迁移募集;②冰冻切片结果显示,过表达CCR7可明显提高骨髓间充质干细胞归巢至损伤脾脏的效率;③流式细胞术测定过表达CCR7的骨髓间充质干细胞归巢至脾脏数量明显高于BMSCs-GFP组(P <0.05);④ELISA结果显示,照射24 h后大鼠外周血中SLC水平明显升高;⑤结果表明,CCR7及其配体SLC对骨髓间充质干细胞的归巢有促进作用。

趋化因子受体7基因修饰的未成熟树突细胞对小鼠移植物抗宿主病的作用研究

目的探讨趋化因子受体7（CCR7）基因修饰的未成熟树突细胞（imDC）对异基因骨髓移植（allo．BMT）小鼠急性移植物抗宿主病（6vno）的影响。方法构建CCR7重组慢病毒载体，包装后感染imDC；以C57BL／6小鼠为供鼠，BABL／c小鼠为受鼠，建立小鼠GVHD模型；实验分为4组，分别为单纯照射组、移植对照组、pXZ9．imDC组（空载体对照）和CCR7-imDC组；通过观察受鼠移植后生存期、GVHD临床评分、组织病理学改变、炎性细胞因子浓度等评价CCR7-imDC防治GVHD的作用。结果单纯照射组、移植对照组、pXZ9-imDC组和CCR7-imDC组小鼠存活时间分别为（8．20±1．48）、（12．20±2．78）、（20．70±6．01）和（27．50±7．55）d，CCR7-imDC组小鼠存活时间明显长于其他各组（P〈0．01）。移植对照组、pXZ9-imDC组和CCR7-imDC组小鼠GVHD评分分别为（6．90±1．66）、（5．60±0．97）和（4．10±1．79）分，CCR7-imDC组较其他两组GVHD评分降低（P〈0．05），组织病理学改变最轻。移植对照组小鼠血清IFN-丫浓度升高，在＋i0d时达高峰，而pXZ9-imDC组和CCR7-imDC组IFN-γ浓度降低，＋20d时降至最低，CCR7-imDC组降低最明湿（P〈0．01）。移植对照组小鼠血清IL-4降低，而pXZ9-imDC组和CCR7-imDC组IL-4浓度渐升高，＋10d达高峰，以CCR7-imDC组升高最明显（P〈0．01）。＋30d，CCR7-imDC组存活受鼠骨髓异基因嵌合率为95％～100％，证实为完全供者型植入。结论CCR7-imDC能够明显延长受鼠的存活时间，减轻急性GVHD的发生。