大鼠miR-133a-3p慢病毒载体的构建及稳转株建立

目的构建大鼠micro RNA-133a-3P(miR-133a-3p)过表达及干扰慢病毒载体,筛选建立稳定表达miR-133a-3p的阴茎海绵体平滑肌细胞(CCSMC)稳转细胞株。方法原代及传代培养CCSMCs,并进行细胞免疫荧光染色鉴定。PCR技术扩增相应目的基因片段并进行酶切,回收后与目的基因连接,产物转化细菌感受态细胞,对阳性克隆测序行对比分析后,使用三质粒包装系统将含有目的基因的重组质粒和辅助包装质粒共转染至293T细胞进行慢病毒包装及纯化,并用荧光法测定病毒滴度。设置miR-133a-3p过表达组、miR-133a-3p干扰组、阴性对照组和空白对照组,在感染复数为10的条件下感染CCSMCs。倒置荧光显微镜下观察各组绿色荧光蛋白的表达情况,浓度为2μg·mL^(-1)嘌呤霉素筛选出稳定表达miR-133a-3p的CCSMCs。qRT-PCR检测慢病毒转染后CCSMCs内miR-133a-3p的表达。结果原代培养的大鼠CCSMCsα-SMA阳性细胞率达90%以上。经测序分析证实重组慢病毒构建正确;过表达及干扰慢病毒滴度分别为3×10^(8)和1×10^(9) TU·mL^(-1);qRT-PCR结果显示,与阴性对照组相比,miR-133a-3p过表达组miR-133a-3p的相对表达量增高,miR-133a-3p干扰组miR-133a-3p的相对表达量降低(P均<0.01)。结论本实验成功构建了miR-133a-3p过表达及干扰慢病毒表达载体,对大鼠CCSMCs进行转染和筛选后,可快速、高效、低成本获得过表达及干扰miR-133a-3p的稳转株。