江苏葫芦科作物上瓜类褪绿黄化病毒的发生及其分离物全基因组序列分析

为了分析瓜类褪绿黄化病毒(cucurbit chlorotic yellow virus,CCYV)在江苏省葫芦科作物上的分布情况、发生趋势以及变异情况,本研究对疑似感染CCYV的葫芦科样本进行采集,覆盖了江苏省8个地区的7种常见葫芦科作物,通过RT-PCR方法对病样进行了分子鉴定,并对在泰州采集的黄瓜分离物CCYV-JSXH进行分段克隆与测序,拼接获得CCYV的全基因组序列后对其进行了序列比对和进化分析。检测结果显示,在建湖采集的西葫芦样本、泰州兴化和南京江宁地区采集的黄瓜样本均有CCYV感染。序列拼接与比对结果显示,分离物CCYV-JSXH的RNA1序列与目前已经公布的各个分离物基因组序列相似度在99.58%以上,在进化树上与山东西葫芦分离物聚为一支;其RNA2序列与各分离株的相似性为99.47%以上,在进化上与广东分离物聚为一支。本研究结果表明,CCYV可能由多个途径传入江苏,并已经扩大蔓延到江苏省多个地区和多种寄主上,对该病毒的监测防控已逐渐扩大为葫芦科作物生产中亟待解决的突出问题之一。

瓜类褪绿黄化病毒外壳蛋白的亚细胞定位及致病作用浅析

瓜类褪绿黄化病毒(cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV)是近些年来出现的一种烟粉虱Bemisia tabaci传播的植物病毒,在瓜类生产中造成了严重损失。为了解该病毒外壳蛋白(coat protein,CP)在病毒侵染寄主过程中的亚细胞定位和致病作用,本研究以CCYV山东黄瓜分离物为研究对象,构建了荧光表达载体CP-YFP和异源表达载体pGR-CP。浸润荧光表达载体48 h后的本氏烟Nicotiana benthamiana叶片在激光共聚焦显微镜下可以观察到荧光信号在细胞质和细胞核内均有分布;浸润异源表达载体的本氏烟植株7 d后上部叶片开始显现花叶症状,13 d后顶部新叶出现严重皱缩和坏死斑点。以上结果表明CCYV CP蛋白参与了病毒对寄主的侵染过程,可能是症状形成的致病相关因子。本研究为进一步解析该病毒的致病机理提供了初步的理论支持。

瓜类新病毒病害(一):瓜类褪绿黄化病

介绍了我国最新发现的瓜类病毒病害—瓜类褪绿黄化病的症状、分布、病害发现历史,病原、寄主范围、传播途径和综合防治措施,并指出未来针对该病害需要开展的研究内容。

瓜类褪绿黄化病毒及其系统进化分析

【目的】检测新疆南疆7个县/市瓜类褪绿黄化病毒(Cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV),进行系统发育分析,为新疆南疆CCYV预警和防控提供参考。【方法】于2019年,从中国新疆南疆7个县/市采集带有黄化特征的51份甜瓜叶片样品,RT-PCR进行CCYV的检测,进行特异性片段的克隆、测序和系统发育分析。【结果】中国新疆巴楚县、阿克苏市、莎车县、伽师县、疏勒县、疏附县均未检测到CCYV,而洛浦县的13份样本中,8份检出为CCYV阳性,检出率为61.53%,洛浦县CCYV特异性片段克隆测序获得了685 bp的核酸序列,与GenBank中的CCYV分离物外壳蛋白(Coat protein,CP)的一致性达到100%。所得序列与中国新疆(吐鲁番)、中国其他省、苏丹、日本、塞浦路斯、黎巴嫩的CP基因聚在I组(Group),沙特阿拉伯的分离物聚在Ⅱ组,伊朗的分离物聚在Ⅲ组。【结论】CCYV在中国新疆南疆洛浦县甜瓜产区发生,与中国新疆吐鲁番、中国其他省及周围国家的CCYV分离物亲缘关系很近,且群体遗传变异很小。

山东寿光黄瓜上瓜类褪绿黄化病毒的分子鉴定

2016年,本研究在对山东黄瓜病毒病调查时发现当地黄瓜上出现一种叶片表现黄化植株伴有轻微矮缩的病害,为明确其中伴随的病毒种类,我们对田间病样进行了采集,提取总RNA后利用瓜类病毒引物进行RT-PCR检测,结果发现在利用瓜类褪绿黄化病毒(Cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV)引物检测样品时,田间采集的25份疑似病样中13份能扩增到400 bp左右的目的条带。为进一步确认,我们又针对CCYV的外壳蛋白基因(CP)设计了特异性引物,对13份阳性样品进行检测,结果均能扩增到目的片段,对获得的CP基因片段进行克隆并测定序列,序列分析结果显示其CP基因序列全长753bp,编码1个由250个氨基酸组成的分子量28700的蛋白质。进一步序列分析结果显示其与CCYV已报道分离物有很高的同源性,并聚类到同一个大的分支,其中与日本分离物、希腊分离物及中国其他地区分离物相对近缘,聚类到一支,而与伊朗分离物近缘关系相对较远。这些结果说明山东黄瓜黄化病样上检测到的病毒为瓜类褪绿黄化病毒,这也是该病毒在山东侵染黄瓜的首次报道。

与瓜类褪绿黄化病毒P22蛋白互作的寄主因子的筛选

为阐明瓜类褪绿黄化病毒(CCYV)的侵染机制,筛选与P22互作的寄主因子。采用免疫沉淀技术结合质谱分析共获得128个寄主蛋白。KEGG分析发现,所获得的寄主因子主要参与到寄主体内的碳水化合物代谢、能量代谢以及信号转移等代谢途径中。将所获得的128个基因进行GO分析,发现筛选到的与P22蛋白相互作用的寄主蛋白分为39个功能组,分别属于生物过程、分子功能和细胞组分三大类别。在生物过程类别中光合作用、蛋白质折叠、葡萄糖代谢过程及碳代谢过程为主要功能组。在分子功能类别中,ATP结合和金属离子结合为主要功能组。在细胞组分类别中生物膜、细胞质和光系统Ⅱ氧化复合体为主要功能组。结合质谱分析结果,根据富集肽段数目和蛋白质功能筛选出8个候选寄主蛋白。KEGG数据库分析表明,8个候选寄主蛋白可能参与或涉及的代谢通路大类可以归为碳水化合物代谢、能量代谢以及信号转移等3个代谢途径。利用酵母双杂交验证8个寄主因子与P22互作。结果表明,甘油醛-3-磷酸脱氢酶A(GAPDH-A)能够与P22蛋白在酵母中互作,推测P22可能影响寄主抗性并参与寄主黄化症状的产生。筛选鉴定了与P22互作的寄主因子,为阐明P22蛋白在CCYV侵染过程中的作用机制奠定了基础。

瓜类褪绿黄化病毒快速检测技术的引物筛选与体系优化

【目的】瓜类褪绿黄化病毒(cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV)是近年来发生的、由烟粉虱Bemisia tabaci半持久性传播的一种植物病毒,给瓜类作物带来严重经济损失。PCR扩增是检测该病毒的常用技术,但目前已报道引物对靶标生物的检测存在扩增结果不稳定、重复性不够的问题。本研究旨在通过筛选多对引物并优化PCR条件获得适合于稳定检测的引物及扩增体系。【方法】以携带有CCYV的根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens GV3101菌株菌液及其侵染获得的CCYV阳性黄瓜叶片cDNA为检测对象,从14对PCR引物中筛选出可用于稳定检测CCYV的引物,同时进行退火温度的优化;以携带有CCYV的根癌农杆菌侵染的阳性黄瓜叶片cDNA为模板,对筛选出来的4对引物及退火温度进行PCR扩增的稳定性和灵敏度检测;利用4对优选PCR引物对13份采自田间的烟粉虱成虫及寄主植物叶片的感毒状况进行检测和验证。【结果】从已报道的14对引物中筛选出4对引物可同时对携带CCYV的根癌农杆菌GV3101菌液及其侵染的CCYV阳性黄瓜叶片cDNA进行稳定扩增,并获得最优的扩增程序。灵敏度检测结果显示,优选的4对引物可检测到CCYV的最低黄瓜叶片cDNA浓度为0.25 ng/μL。利用优选的4对引物通过PCR对13份采自田间的烟粉虱成虫及其寄主植物叶片的CCYV检测发现,测试样本的CCYV阳性率为69.23%。【结论】优选的4对引物及其对应的优化扩增程序可用于对携带有CCYV的根癌农杆菌及其侵染的植物叶片以及田间样本是否感染CCYV的检测。

瓜类褪绿黄化病毒对黄瓜叶片营养及防御反应的影响

研究了由烟粉虱(Bemisia tabaci)半持久性传播的瓜类褪绿黄化病毒(cucurbit chlorotic yellows virus;CCYV)对黄瓜叶片营养物质含量和重要防御物质及防御相关基因的影响。采用蒽酮、福林酚等化学显色法测定了感染CCYV和健康黄瓜植株在5 d及15 d可溶性糖、游离氨基酸、总酚、单宁的含量,采用qRT-PCR测定了3种参与水杨酸或茉莉酸途径的抗病防御基因(PR1,PR3和CAT)在感染CCYV不同时间点的变化。试验结果表明,CCYV显著降低了黄瓜叶片防御物质总酚、单宁的含量,同时可溶性糖和游离氨基酸等营养物质含量也显著降低。防御性物质的降低有利于介体昆虫的韧皮部取食行为,能够促进介体昆虫的获毒和传毒效率,而营养物质含量的降低可能是驱动介体昆虫获毒之后转移寄主的因素之一。感染CCYV 5 d和15 d的黄瓜植株PR1基因表达均显著下调;而PR3基因在5 d时表达显著下调,但在15 d时与健康植株表达差异不显著;CAT基因表达量在感染CCYV 5 d和15 d均显著上调。这说明CCYV可能以不同的方式调控植物的防御反应基因。

安徽省太和县瓜类褪绿黄化病毒自然侵染南瓜的检测分析

采集安徽省太和县南瓜具有典型症状的病叶样品进行RT-PCR检测鉴定,并结合测序结果确定为CCYV。为了更加明确安徽太和地区CCYV的来源和序列的变异情况,测定了该病毒的外壳蛋白(coat protein,CP)序列进行系统发育分析,结果表明,此次安徽太和县所检测到的分离物与我国其他地区的分离物以及以色列、日本和希腊等国家存在较小的地域差异性,亲缘关系较近,而与伊朗地区的分离物亲缘关系相对较远。该研究是安徽省CCYV侵染南瓜的首次报道,以期为该病害的预警和防控提供理论基础和科学对策。

甜瓜褪绿黄化病毒病综合防控技术

通过采用高锰酸钾、石灰氮、生石灰等土壤消毒技术,嫁接栽培技术,覆盖防虫网、悬挂黄板等物理防治技术,释放丽蚜小蜂的生物防治技术,喷施杀虫剂的化学防治技术,以及喷施叶面肥技术,构建了甜瓜褪绿黄化病毒病综合防控技术,能够有效控制甜瓜褪绿黄化病毒病的流行危害,防控效果可达72%。

海南省和河南省发生甜瓜褪绿黄化病的分子鉴定

【目的】为了探明引起海南省和河南省甜瓜褪绿黄化的病因,【方法】提取从海南三亚和河南郑州采集的甜瓜叶片的RNA,用CCYV特异性引物进行外壳蛋白基因的克隆、测序,并与GenBank中同属或同种病毒的cp基因核苷酸序列构建系统进化树。【结果】结果显示,RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,所得条带在880 bp左右,与预期的一致;构建cp基因的系统进化树发现,样品与瓜类褪绿黄化病毒(Cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV)的亲缘关系很近,属于同一个分枝,而与该病毒同属不同种的南瓜黄矮失调病毒(Cucurbit yellow stunting disorder virus,CYSDV)和大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf virus,BYDV)的亲缘关系较远,属于不同的分枝。【结论】证实海南省和河南省甜瓜褪绿黄化病是由瓜类褪绿黄化病毒引起。

甜瓜褪绿黄化病毒病综合防控技术

本文通过对甜瓜褪绿黄化病毒病在嫁接、物理防治、化学防治、叶面追肥、土壤处理方面的研究,构建了对该病的综合防治技术,此技术在一定程度上能控制甜瓜褪绿黄化病毒病的流行危害。

北海市设施大棚内哈密瓜褪绿黄化病毒病发生情况及防控对策

本文描述了北海市设施大棚内哈密瓜的褪绿黄化病毒病发生情况,分析其发生原因,并提出了综合防控建议。

侵染地黄的瓜类褪绿黄化病毒基因组序列克隆及系统进化分析

为地黄脱毒及防控瓜类褪绿黄化病毒(cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV),从河南省温县、武陟县和禹州市3个主产区采集60份具有花叶、黄化和褪绿等典型症状的地黄病叶样品,利用高通量测序技术对混合病样进行测定,利用CCYV-CPF/CPR和CCYV-P22F/P22R引物对60份样品进行反转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)检测,并利用9对引物对侵染地黄的CCYV全基因组序列进行扩增和克隆,用DNAMAN 6.0软件对CCYV的分子变异进行分析,利用MEGA X 10.0软件构建系统发育树。结果显示,60份地黄病叶样品中检测出了蚕豆萎蔫病毒2(broad bean wilt virus 2,BBWV2)、地黄花叶病毒(Rehmannia mosaic virus,ReMV)、油菜花叶病毒(youcai mosaic virus,YoMV)和CCYV等病毒;在60份样品中,有22份样品中检测到CCYV,检出率为36.7%;21个地黄分离物之间的CP基因核苷酸和氨基酸序列一致率分别为99.3%~100.0%和98.4%~100.0%,与其他分离物之间的CP基因核苷酸和氨基酸序列一致率分别为94.6%~100.0%和96.8%~100.0%,17个地黄分离物之间的P22基因核苷酸和氨基酸序列一致率分别为98.4%~100.0%和96.3%~100.0%,与其他分离物之间的P22基因核苷酸和氨基酸序列一致率分别为96.1%~100.0%和94.1%~100.0%;基于CP和P22基因核苷酸序列的系统发育树结果显示,CCYV不同分离物形成2个分支。CCYV地黄分离物的基因组包含RNA1和RNA2两个组分,全长分别为8607 nt和8041 nt,共编码12个蛋白;CCYV地黄分离物基因组高度保守,与其他分离物基因组RNA1和RNA2的核苷酸一致率均为99.7%~100.0%,基于基因组的系统发育树结果显示,CCYV地黄分离物的核苷酸序列与其他寄主上CCYV分离物的核苷酸序列聚为一个分支,而与毛形病毒属Crinivirus的其他病毒分开。

瓜类褪绿黄化病毒在山东省的流行调查及西葫芦分离物全基因组扩增与序列分析

瓜类褪绿黄化病毒(cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV)给我国葫芦科作物造成了严重的经济损失。2014—2019年持续调查山东葫芦科作物产区CCYV的发生情况。调查结果表明:CCYV可以自然侵染西瓜、甜瓜、南瓜、黄瓜和西葫芦,样品检出率由2014年的1.7%增加到2019年的29.1%,西葫芦地块发病严重有进一步蔓延的趋势。利用RT-PCR结合RACE技术扩增CCYV西葫芦分离物全基因组序列。结果表明:CCYV西葫芦分离株的基因组RNA1和RNA2与GenBank分离株的相似性均为99.6%~100%,基于CCYV全基因组的系统发育进化树均聚类在一个分支上,与各个蛋白的进化树和相似性分析结果一致,CCYV在传播的过程中与寄主无关但可能跟地理位置有关。本研究扩增分析了CCYV西葫芦分离物的基因组序列,对CCYV的变异现状和进化趋势研究具有一定的参考价值。

贵州首次报道瓜类褪绿黄化病毒侵染山药

山药(Dioscorea oppositifolia),又名薯蓣、山薯、大薯,属薯蓣科(Dioscoreaceae)薯蓣属(Dioscorea)藤本植物,其块茎富含蛋白质、淀粉、多糖、矿物质等营养元素,可作为药用或食用材料。大多数山药块茎为一年生,部分山药的块茎逐年增大并木质化形成地下茎。贵州安顺山药种植已有300年的历史,已获全国农产品地理标志。随着安顺山药种植规模的扩大,长期留种出现病毒累积、品种退化的现象。

瓜类褪绿黄化病毒新疆分离物基因组分析

2016年秋季,新疆维吾尔自治区吐鲁番市哈密瓜大面积发生叶片黄化和褪绿的病害,症状呈瓜类褪绿黄化病毒(Cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV)引起的典型特征。通过CCYV的特异性引物对该疑似样本进行了RT-PCR检测,获得了预期大小的扩增片段。随后,对新疆的CCYV分离物(CCYV-Xinjiang)全长基因组进行克隆并测序,获得了CCYV-Xinjiang分离物的RNA1和RNA2全长序列信息。对CCYV-Xinjiang和来自Gen Bank数据库的其他CCYV分离物的基因组序列分析,不同分离物RNA1和RNA2两条链的一致性分别是99.65%~99.93%和99.68%~99.89%。单独对基因组的各个非翻译区(UTRs)和编码区的核苷酸变异分析,数据表明不同区域其变异程度不同,其中RNA2的3'UTR区域变异最大,而RNA1的2个UTRs区域变异最小。对已登录Gen Bank的所有CCYV分离物基因组系统进化树分析结果表明,所有分离物聚在同一个组。另外,对来自Gen Bank的18个分离物的外壳蛋白(CP)氨基酸序列进行系统进化树分析,表明来自伊朗的3个分离物分在组2(GroupⅡ),而来自亚洲其他地区的分离物均被分到组1(GroupⅠ)。基于CCYV基因组的信息,发现来自亚洲地区的CCYV的群体遗传变异很小。

瓜类褪绿黄化病毒p22基因在大肠杆菌中的表达及抗血清的制备

以被瓜类褪绿黄化病毒(Cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV)侵染的甜瓜叶片为供试材料,采用RT-PCR方法克隆其P22蛋白基因,并将其连接到原核表达载体pGex-4T-3上,PCR验证及克隆测序确定开放阅读框的正确性。将重组载体pGexp22转化大肠杆菌BL21菌株,诱导表达,SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,p22基因在大肠杆菌BL21中得到了高效表达。以表达的蛋白作为抗原,免疫家兔,制备了CCYV P22的特异性抗血清。ACP-ELISA检测结果表明,血清效价高达1.28×105。Western blot检测甜瓜叶片,结果表明抗血清能够特异性地检测CCYV侵染的甜瓜叶片中的CCYV P22蛋白。

瓜类褪绿黄化病毒外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达及抗血清的制备

根据已报道的瓜类褪绿黄化病毒(Cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV)外壳蛋白(CP)基因的核苷酸序列设计引物,利用RT-PCR方法从感病甜瓜中扩增得到长度为753 bp的CP基因,将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-3上,获得重组载体pGexCP,在大肠杆菌BL21菌株中诱导表达,SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,CP基因在大肠杆菌BL21中得到了高效表达。以表达的蛋白为抗原,免疫家兔,制备了CCYV外壳蛋白的特异性抗血清。ACP-ELISA检测结果表明,当CP蛋白浓度为2.5μg/mL时,血清效价高达5.12×105。Western blot分析表明制备的抗体检测CCYV侵染的甜瓜叶片得到特异性的条带,表明该抗体的特异性较好。ACP-ELISA检测结果表明,制备的抗血清可用于田间甜瓜病样的检测。本试验为CCYV的快速检测提供了重要的研究材料。

瓜类褪绿黄化病毒对烟粉虱取食行为的影响

瓜类褪绿黄化病毒(Cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV)是近年来报道的一种新病毒,由B型和Q型烟粉虱[Bemisia tabaci(Gennadius)]以半持久性方式特异性传播,其各项研究工作均处于起步阶段,烟粉虱传播该病毒的机理目前尚无文献报道。本研究以B型和Q型烟粉虱、CCYV宿主黄瓜和非宿主棉花为试验材料,利用刺吸电位(electrical penetration graph,EPG)技术比较两种生物型烟粉虱在带毒和无毒状态下的取食行为,期望阐明CCYV病毒、烟粉虱和寄主植物之间的互作关系,为烟粉虱及其所传播病毒的有效治理奠定理论基础。本研究取得的主要结果如下:(1)B型和Q型烟粉虱两性成虫在黄瓜上的取食行为。带毒B型较无毒B型在黄瓜上有显著多的非韧皮部刺探和显著长的韧皮部唾液分泌时间(P<0.05),带毒B型雄性或雌性与带毒B型整体表现不同。Q型烟粉虱带毒后在黄瓜韧皮部有显著多的唾液分泌和刺探取食(P<0.05)。与无毒烟粉虱相比,带毒B型和Q型烟粉虱的取食行为差异缩小了。对于带毒雄性,B型较Q型有显著多的韧皮部的刺探次数(P<0.05)。对于雌性,无毒B型较无毒Q型有更多的非韧皮部刺探,而带毒Q型雌眭较带毒B型则有显著多的非韧皮部刺探(P<0.05)。(2)B型和Q型烟粉虱两性成虫在棉花上的取食行为。带毒B型较无毒B型有显著多的非韧皮部刺探(P<0.05)。带毒B型雄性烟粉虱和B型烟粉虱的整体表现一致的。带毒B型雌性比无毒B型雌性有显著多的非韧皮部刺探(P<0.05)。带毒Q型较无毒Q型在棉花有显著多的非韧皮部刺探和韧皮部取食(P<0.05)。带毒Q型烟粉虱两性在棉花上的表现与带毒Q型烟粉虱整体是一致的。(3)B型和Q型烟粉虱两性成虫在黄瓜和棉花上的取食行为。无毒B型在黄瓜非韧皮部有显著多的刺探(P<0.05),而在棉花上有较多韧皮部取食(P<0.05)。带毒B型雄陛在棉花韧皮部有较多的取食(P<0.05)。带毒Q型有显著多的棉花韧皮部刺探取食(P<0.05)。无毒Q型雄性在棉花上有显著多的非韧皮部刺探和韧皮部取食(P<0.05)。带毒Q型雄性在黄瓜上有显著多的非韧皮部刺探,而在棉花上有显著多的韧皮部取食(P<0.05)。无毒和带毒Q型雌性在棉花上均有显著多的韧皮部取食(P<0.05),而带毒Q型雌性在黄瓜非韧皮部有显著多的刺探次数和时间(P<0.05)。通过以上实验和分析,得出的研究结论为:B和Q型烟粉虱携带CCYV病毒后,取食能力均有不同程度的变化。其中,在黄瓜上,CCYV促进了两种生物型烟粉虱的刺探取食,但对B型烟粉虱的取食促进强于Q型烟粉虱;CCYV对B型雄性韧皮部促进作用强于雌性,而对Q型雌性的取食促进强于Q型雄性。在棉花上,CCYV促进了B型烟粉虱对非韧皮部的刺探,而促进了Q型烟粉虱的韧皮部取食能力;CCYV对B型雄性的取食促进强于B型雌性,而对Q型烟粉虱两性成虫的影响是一致的,均促进了其在韧皮部取食。因此,CCYV修饰了其介体烟粉虱的取食行为,使介体的行为更有利于病毒的传播,而病毒对介体的影响因植物、介体和介体性别不同而有所差异。