橡胶树HbCCoAOMT家族基因的鉴定

为了进一步了解HbCCoAOMT基因在橡胶树(Hevea brasiliensis)生长发育和抵抗逆境中的作用,本研究通过分析巴西橡胶树的全基因组测序数据,对HbCCoAOMT家族基因进行鉴定分析,得到了40个HbCCoAOMT家族成员,探讨其在染色体上的分布、结构域特征及组织特异性。结果显示,橡胶树共有18条染色体,HbCCoAOMT成员只分布于1、3、4、11、13、17、18这7条染色体上。表达模式分析发现,有12个成员在所有5个组织中均有表达;HbCCoAOMT酶活检测结果表明,在橡胶树的茎中HbCCoAOMT酶活性最高。此外,从橡胶树中成功克隆获得表达丰度最高的HbCCoAOMT1基因,该基因CDS长746 bp,编码241个氨基酸。将HbCCoAOMT1构建在原核表达载体pET28a上,并在大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中成功表达HbCCoAOMT1重组蛋白。分析HbCCoAOMT1启动子区域发现多种激素或胁迫相关顺式作用元件。

‘砀山酥梨’果实CCoAOMT基因的克隆与表达分析

[目的]通过克隆‘砀山酥梨’(Pyrus bretschneideri ‘Dangshansuli’)果实中咖啡酰-辅酶AO-甲基转移酶(CCoAOMT)基因的全长序列,并对其进行生物信息学及基因表达差异分析,阐释了其在梨果实木质素合成途径的作用,以期为今后利用基因调控技术来改变果实中石细胞含量从而改善梨果实品质提供一定的理论依据。[方法]以15年生‘砀山酥梨’果实为试材,根据从NCBI数据库中搜索得到关于植物木质化的CCoAOMT基因序列与梨基因组数据库调取的序列比对,利用RT-PCR技术克隆得到了木质素生物合成途径中的一种关键酶基因PbCCoAOMT,GenBank登录号为KJ577544。[结果]该基因全长1133bp,具有1个744bp的完整开放阅读框(ORF),编码247个氨基酸。序列比对及系统进化树分析表明:CCoAOMT酶是氧甲基转移酶类,与其他植物CCoAOMT编码的蛋白序列有较高的相似性,尤其与枇杷的相似度最高,达到98.79%,且亲缘关系最近。利用荧光定量PCR技术对其在果实不同发育时期表达模式的分析发现,基因表达量呈先上升后下降的趋势,与梨果实中石细胞含量的变化趋势相似。[结论]初步认为从‘砀山酥梨’中克隆得到的PbCCoAOMT基因可能参与了梨果实中木质素的代谢。

杉木CCoAOMT基因部分cDNA克隆与序列分析

利用CODEHOP设计CCoAOMT基因的简并引物,通过RT-PCR的方法,从杉木茎段中克隆到1个长度为614 bp的PCR产物,产物经pMD18-T载体克隆转化至DH5α大肠杆菌中,序列通过同源性比对后显示该片段与其它植物的CCoAOMT基因具有较高的同源性.利用生物信息学方法分析发现,该序列在112－651 bp片段上有一个开放性阅读框,该序列编码的是一个酸性蛋白,亲水性较弱,疏水性较强;信号肽序列为第23位至第45位,二级结构以α-螺旋（40.62%）与不规则盘绕（45.31%）为主,没有发现β转角区域.

赤桉CCoAOMT亚家族的基因克隆及可变剪接分析

通过同源克隆策略和RACE技术获得赤桉CCoAOMT亚家族2个成员的全长cDNA序列。CCoAOMT1基因的全长cDNA序列为1 020 bp,其中可读框ORF长度为738 bp,5’-UTR为106 bp,3’-UTR为176 bp;CCoAOMT2基因的全长cDNA序列为1 047 bp,其中可读框ORF长度为741 bp,5’-UTR为125 bp,3’-UTR为158bp。CCoAOMT1和CCoAOMT2基因都由5个外显子组成,主要的区别在于前者第1个内含子存在5’端可变剪接位点,形成2条不同长度的mRNA,一条的ORF长度为738 bp,而另一条比前者缺失了42 bp,但不影响其余氨基酸的读码框顺序。赤桉CCoAOMT1基因在茎段中可变剪接发生在5—9月间,是桉树一年中树高和直径增长最快的阶段,这个可变剪接可能与组织器官生长发育有关。蛋白质三维结构分析表明,CCoAOMT能形成正确的酶活性中心与底物结合位点。抑制CCoAOMT基因表达,降低桉树木质素对于减少制浆造纸工业污染具有重要意义。

分离克隆苎麻CCoAOMT基因部分序列

以苎麻[Boehmeria nivea(L.)Gaud]为材料,研究木质素代谢的关键酶苎麻咖啡酰辅酶A甲基转移酶基因序列。分离了高纯度RNA和DNA。以RNA为模板,用简并引物以RT-PCR的方法,克隆了苎麻CCoAOMT基因cDNA部分序列,长度为486 bp,编码162个氨基酸残基。此cDNA序列为苎麻植物中首次克隆的(caffeoyl-CoA 3-O-methyltransferase,CCoAOMT)新基因序列。GenBank注册,登录号为AY651026。以苎麻4个栽培品种基因组DNA为模板,经温度梯度PCR条件优化,获得苎麻CCoAOMT基因的部分基因组序列,GenBank注册号为AY818191(湘苎3号,922 bp)、AY822619(圆麻,915 bp)、AY822620(芦竹青,914 bp)、AY822622(青麻,914 bp)。生物信息学分析结果发现,苎麻4个栽培品种的CCoAOMT基因基因组DNA片段序列有一定的差异。

反义CCoAOMT基因调控烟草木质素的生物合成

[目的]研究木质素的生物合成及调控,降低木质素的含量或改变其组分。[方法]用农杆菌介导法将苎麻反义CCoAOMT基因导入烟草,采用PCR及Southern印迹对获得的转基因植株进行分子检测,并测定移栽3个月转基因植株Klason木质素及纤维素含量。[结果]转基因烟草与野生型对照相比木质素平均含量降低了16.8%,纤维素平均含量升高了15.2%,并且植株生长正常。[结论]抑制植物CCoAOMT表达是反向调控转基因植物木质素生物合成的有效途径。

巨龙竹木质素合成关键基因CCoAOMT的克隆及表达分析

咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT,caffeoyl-CoA O-methyltransferase)是木质素合成过程中关键酶之一。研究通过逆转录PCR(RT-PCR)从巨龙竹(Dendrocalamus sinicus L.C.Chia&J.L.Sun)发育早期的竹笋中克隆了CCoAOMT基因(DsCCoAOMT),基因全长cDNA序列为777 bp,编码258个氨基酸,理论分子量28.85 kD,等电点为5.35,蛋白质结构预测的结果显示该蛋白含有丰富的α-螺旋和无规则卷曲。系统进化分析表明,巨龙竹CCoAOMT基因与禾本科植物CCoAOMT基因同源性最高,亲缘关系最近;与非禾本科单子叶植物的亲缘关系次之,然后是裸子植物,与双子叶植物的亲缘关系最远,说明CCoAOMT基因在双子叶植物和单子叶植物之间的差异可能在被子植物进化之前就已经存在。DsCCoAOMT基因密码子偏好性分析的结果显示,该基因选择偏性较强且偏好以G/C结尾;密码子使用频率比较结果发现,DsCCoAOMT基因在微生物中异源表达分析时采用酵母表达系统更为合适,而模式植物拟南芥、烟草、番茄与巨龙竹CCoAOMT密码子使用频率差异较小,尤其烟草、番茄可能是该基因进行转基因功能验证时最为理想的受体。实时荧光定量PCR分析巨龙竹不同组织及竹笋发育过程中DsCCoAOMT基因表达水平的结果显示,该基因在巨龙竹不同组织中的表达具有明显差异,竹笋中表达量最高,茎秆中次之,叶片中最少;随着竹笋的发育,DsCCoAOMT基因的表达量上调并在竹笋发育中期维持较高水平,表明DsCCoAOMT基因可能在巨龙竹快速生长中发挥重要调节作用。本研究的结果为进一步阐明DsCCoAOMT基因的功能和作用机制奠定了基础。

青杨CCoAOMT基因的克隆及其生物信息学分析

以一年生青杨(Populus cathayana Rehd.)嫩茎为试材,利用RT-PCR技术克隆青杨CCoAOMT基因,并对其进行生物信息学分析。结果表明,该基因cDNA序列全长为747 bp,是一个编码248个氨基酸的多肽,蛋白分子量为27.67 kD,等电点为5.19,将该基因命名为PcCCoAOMT,其编码的蛋白质为是亲水性蛋白质;氨基酸序列和结构分析表明,CCoAOMT有一个保守区域;系统进化分析表明,PcCCoAOMT与毛果杨的PtCCoAOMT基因具有很高的同源性(87%),该基因功能可能与青杨木质素的生物合成有关。

白桦反义CCoAOMT基因调控木质素生物合成

白桦是我国北方重要的造林树种,但其中的高木质素含量严重制约了它作为造纸资源植物的开发利用。本文利用RACE技术获得了白桦咖啡酰辅酶A-3-O-甲基转移酶(CCoAOMT)基因全长ORF序列,并构建了白桦CCoAOMT基因的反义表达载体,通过农杆菌介导法将其导入到白桦中。PCR检测表明反义CCoAOMT基因已整合到白桦的基因组中。对转化植株的半定量PCR检测显示转基因株系的CCoAOMT基因表达量下降;Wiesner染色发现,与野生型相比,转基因植株木质素含量有所下降。对七年生的转基因白桦和野生型对照进行了化学成分分析,结果表明转基因白桦的苯醇抽提物和Klason木质素显著减少,聚戊糖含量升高。上述结果暗示BpCCoAOMT基因参与白桦木质素的合成,反义表达该基因后木质素含量减少,更易于去除。白桦CCoAOMT基因对木质素的合成起重要作用,这为培育低木质素含量的制浆新品种白桦奠定了基础。

光皮桦BlCCoAOMT基因的克隆、表达及单核苷酸变异分析

咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)是植物木质素合成过程中的一个关键酶,对木质素组成和结构有重要的作用。为探究BlCCoAOMT基因在木质素合成中的作用,本研究从光皮桦中克隆了该基因,并分析其基因结构和表达模式,以及在73个基因型中的单核苷酸多态性(SNP)。结果表明,BlCCoAOMT基因cDNA全长1 114 bp,含有一个744 bp的完整ORF,编码一个由247个氨基酸残基组成的蛋白;该编码蛋白包含高等植物CCoAOMT所有的8个典型保守基序。BlCCoAOMT在木质化茎段中优势表达,且随着木质化程度提高而逐渐增强,表明BlCCoAOMT可能参与光皮桦木质素的生物合成;在拉弯处理的6 h到7 d间,该基因在应拉区发育木质部中的表达显著下调,与应拉木木质素含量的下降相符。共检测到BlCCoAOMT基因有119个SNP位点,平均每14 bp就有1个SNP位点,其中在外显子区域存在26个SNP位点,表明不同基因型中存在丰富SNP变异;在不同群体间BlCCoAOMT基因的分化程度无显著差异,且非同义突变和同义突变的位点的比值均小于1,表明在演化进程中主要受到了纯化选择压力。本研究结果为深入解析光皮桦木质素合成分子机制及后续分子标记辅助育种提供了理论依据。

柚CCoAOMT基因的克隆与超表达载体构建

为探明咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)在柚[Citrus maxima(Burm.)Merr.]果实发育中对木质素单体合成的影响,克隆了柚CCoAOMT基因ORF序列并构建超表达载体转化至农杆菌。采用Trizol法提取柚汁胞总RNA,经反转录得到cDNA,根据已知柚CCoAOMT片段序列,设计其ORF引物。PCR扩增得到柚CCoAOMT基因ORF序列,长度为744 bp,编码247个氨基酸,与龙眼(Dimocarpus longan)、麻疯树(Jatropha curcas)、杨树(Populus balsamifera)的CCoAOMT基因同源性大于90%。经软件预测,该酶定位于质膜的可能性最大,不具有跨膜结构。将柚CCoAOMT基因正向导入植物过表达载体p1301,位置在CaMV35S启动子的之后,并将载体转化至农杆菌EHA105。本研究得到的基因片段包含柚CCoAOMT基因ORF,成功构建植物超表达载体p1301-cmCCoAOMT,并导入农杆菌。含p1301-cm CCoAOMT的农杆菌株可转化多种植物受体,为深入研究该基因功能奠定了基础。

‘砀山酥梨’褐皮芽变木质素含量及相关酶活性与CCoAOMT表达量分析

为了探讨‘砀山酥梨’芽变品系‘锈酥’果皮褐色形成机理,采用分光光度法测定盛花后25、50、75、100、125、150和175d果皮中木质素含量和相关酶活性变化;从构建的‘锈酥’正向SSH-cDNA文库中筛选出与木质素生物合成密切相关的CCoAOMT-EST,通过实时荧光定量PCR测定了‘砀山酥梨’和‘锈酥’果皮中CCoAOMT的相对表达量。结果表明:‘锈酥’果皮发育前期木质素增量较大,且木质素增量累计比‘砀山酥梨’高12.2%;‘砀山酥梨’和‘锈酥’果皮中PAL、4CL、CAD酶活性均在花后75d达到最大值,而POD酶活性则在花后125d出现高峰;二者果皮中4种酶活性变化趋势基本一致,但‘锈酥’果皮中均相对较高;‘锈酥’果皮中的PAL和4CL酶活性与木质素增量变化均呈显著正相关,而‘砀山酥梨’则未呈现出此规律;在果实生长发育各个时期,‘锈酥’果皮中CCoAOMT相对表达量均高于‘砀山酥梨’。因此推测,‘锈酥’果皮褐色形成与果皮中木质素积累及相关酶活性提高有关,果皮中CCoAOMT的增量表达是‘锈酥’果实褐皮形成的重要原因之一。

荸荠CCoAOMT基因的克隆与表达分析

咖啡酰辅酶-A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)是植物木质素合成的关键酶之一。为探明CCoAOMT在荸荠木质素单体合成过程中的作用,本研究利用RACE技术在荸荠球茎中克隆CCoAOMT基因的全长序列,并对其在不同组织和鲜切荸荠贮藏过程中的表达进行分析。结果表明,克隆得到荸荠CCoAOMT基因cDNA全长1 302 bp,将此基因命名为CwCCoAOMT,其GenBank登录号为MG719240。该序列包含一个786 bp的最大开放阅读框,可编码261个氨基酸,其DNA中包含4个内含子和5个外显子。该蛋白的分子量为29.17kD,理论等点为5.21。CCoAOMT蛋白二级结构中α-螺旋占37.55%,无规则卷曲占35.63%,延伸链占19.16%,β-折叠结构占7.66%。序列比对和系统进化树分析表明,Cw CCoAOMT蛋白与其它植物CCoAOMT蛋白序列相似度较高,其中与慈竹的亲缘关系最近。通过各组织表达特性分析发现,CwCCoAOMT在荸荠皮中的表达最高,在荸荠肉中的表达最低。在鲜切荸荠贮藏过程中CwCCoAOMT的表达呈快速上升趋势,而水杨酸处理能显著抑制CwCCoAOMT表达上升。本实验结果可为控制鲜切荸荠黄化的研究提供理论依据。