补体调节蛋白CD 46、CD 55和CD 59在胃肠肿瘤中的研究进展

胃肠肿瘤细胞的细胞膜高表达补体调节蛋白(complement regulatory proteins,CRPs)中的一种或几种分子。这些高表达分子可抑制机体的体液免疫和细胞免疫,可能是导致肿瘤细胞逃避机体免疫监视的机制之一。近年来许多学者在研究CRPs在胃肠肿瘤中的表达及其作用机制,以及将CRPs相关的单克隆抗体(monoclonal antibodies,McAbs)应用于肿瘤免疫治疗,取得了一定疗效。本文将CRPs在胃肠肿瘤研究中所取得的进展作一综述。

CD46基因在家畜抗病育种中的应用研究进展

补体调节蛋白46(complement regulator protein, CD46)在大多数哺乳动物的细胞上广泛表达。除了具有补体失活、调节T细胞活化和生育能力等多种生理功能之外,CD46也可以作为多种细菌和病毒的受体,尤其对牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)和经典猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)的附着起重要作用。利用基因编辑技术特异修饰CD46成功生产出抗BVDV活牛犊,证明该基因可以作为抗病育种的候选基因。本文主要对CD46蛋白在家畜病毒感染中的作用以及在抗病育种中的应用进行综述。

虹鳟补体活化调节因子CD46的分子特征及功能

为进一步研究硬骨鱼类中补体活化调节因子的分子特征和功能,研究克隆了虹鳟(Oncorhynchus mykiss)的CD46基因,对其分子特征进行了系统分析,结果显示:虹鳟CD46基因由10个外显子和9个内含子组成,cDNA序列全长2812 bp,编码317个氨基酸,蛋白序列由1个信号肽、4个SCR结构域、1个跨膜区和1个胞内区组成,预测分子量为33.9 kD。基因组共线性分析显示,虹鳟CD46基因位于16号染色体,其基因座在脊椎动物中具有保守的共线性。组织和白细胞亚群表达分析显示,虹鳟CD46基因在各种组织和白细胞亚群中均有表达。为了进一步阐明虹鳟CD46的免疫功能,研究原核表达纯化了标签蛋白GST和融合蛋白GST-CD46。溶血活性实验表明,与GST相比,GST-CD46能够显著抑制虹鳟血清对兔红细胞的溶血活性,且呈现剂量依赖效应,表明虹鳟CD46是补体活化的调节因子。此外,研究用HEK293T细胞过表达了GFP和GFP-CD46。细胞损伤实验显示,与GFP相比,GFP-CD46能够显著抑制虹鳟血清对HEK293T细胞的损伤,进一步表明虹鳟CD46是补体活化的调节因子,能够保护细胞免受补体系统的损伤。总之,研究不仅增加了对虹鳟CD46的分子特征和功能的认知,还为深入研究此分子的免疫功能及其在抗病免疫中的应用提供了理论基础。

CD46 RNAi对CD59介导的T细胞信号转导的作用研究

目的构建携带针对CD46基因的pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体,研究糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白CD59与CD46在介导T细胞信号转导中的相关性。方法将能转录产生靶向CD46小发夹RNA(shRNA)的寡核苷酸序列,克隆入逆转录病毒载体pSUPER retro,转化大肠杆菌JM109并转染Jurkat细胞。将Jurkat细胞分为未转染的Jurkat细胞组(Ⅰ组)、转染空质粒的Jurkat细胞组(Ⅱ组)、转染CD59干扰质粒的Jurkat细胞组(Ⅲ组)及转染CD46干扰质粒的Jurkat细胞组(Ⅳ组)。用RT-PCR、Western blot技术检测各组细胞中的CD59、CD46基因的表达水平。用噻唑蓝(MTT)比色法检测CD46与CD59联合作用对4组Jurkat细胞的增殖效应。结果重组载体经PCR及限制性内切酶酶切鉴定初步成功后送测序,结果表明序列正确,构建成功,稳定转染后,Ⅳ组细胞CD46分子的表达被成功抑制,Ⅲ组细胞CD59分子的表达被抑制。Ⅰ组和Ⅱ组细胞CD46与CD59单抗联合作用后,增殖能力明显高于Ⅲ组、Ⅳ组(P<0.05);但Ⅰ组和Ⅱ组,Ⅲ组和Ⅳ组之间无差异。结论 CD59可增强CD46对T细胞信号转导的效应。

GPI锚固型CD46/CD55嵌合分子的设计及构建

目的 选取调控补体活化中心环节C3转化酶的两种膜调节蛋白CD4 6和CD5 5 ,设计构建了新型的GPI锚固型CD4 6 /CD5 5嵌合分子。方法 以CD4 6cDNA和CD5 5cDNA为模板 ,通过PCR及PCR重叠延伸技术 (SOE)得到CD4 6 /CD5 5嵌合cDNA。为避免双分子连接后的空间结构和功能的变化 ,在CD4 6与CD5 5之间引入了多肽氨基酸接头 (Linker) ,然后克隆构建GPI锚固型CD4 6 /CD5 5 BluescriptM13克隆载体。结果 获得了阅读框完整、连接部位正确的GPI锚固型CD4 6 /CD5 5嵌合分子cDNA。结论 本研究为研制开发新一代的多功能。

人CD46基因启动子的克隆和启动特性研究

为研究人CD46(hCD46)基因启动子的启动特性,研制具有hCD46组织特异性表达特征的转基因小鼠,设计扩增hCD46基因启动子的PCR引物,用HeLa细胞基因组DNA为模板扩增hCD46基因启动子DNA片段,测序结果表明:其序列与GenBank中hCD46完整基因5′端某片段的同源性高达99.9%。用此DNA片段替换表达载体pcD-NA3EGFP中的CMV启动子,且在该片段与EGFP基因之间插入兔β-球蛋白基因的第2内含子RGI。重构的表达载体在2种鼠源细胞CHO和SP2/0中均可启动EGFP表达,表达量与人体内同源组织中hCD46的相似,说明该研究克隆了结构和功能正确的hCD46基因启动子。

原代培养的小鼠星形胶质细胞CD46、CD55、CD59的表达及炎症刺激因子对其的影响

目的通过体外培养小鼠大脑皮层星形胶质细胞,明确补体调节蛋白CD46、CD55、CD59在原代小鼠大脑皮层星形胶质细胞上的表达情况,及炎症因子对CD46、CD55、CD59表达的影响,为研究补体系统在AD中的作用打下基础。方法原代纯化培养小鼠星形胶质细胞,用RT PCR,免疫荧光的方法,分别在mRNA水平、蛋白质水平,检测炎症因子刺激前以及LPS、IFNγ单独或协同刺激后,CD46、CD55、CD59的表达情况。结果RT PCR检测到CD59mRNA的表达,CD46、CD55的表达不明确,未刺激组和刺激组无明显差别;免疫荧光结果示CD59阳性,CD46、CD55弱阳性。结论保护素CD59在原代小鼠星形胶质细胞上显著表达,可能可以保护星形胶质细胞免受补体的溶破效应的杀伤。

人非小细胞肺癌CD46分子的表达及临床意义研究

目的:研究人非小细胞肺癌组织中CD46的表达水平及意义。方法:免疫组织化学检测人非小细胞肺癌组织中CD46的表达水平,分析其与肿瘤发生发展的相关性。结果:检测66例非小细胞肺癌组织样本,24例鳞癌中14例CD46表达阳性(71.4%),42例腺癌中37例CD46表达阳性(88.1%);66例标本中40例TNM早期患者有32例CD46表达阳性(80.0%),26例TNM中晚期患者有19例CD46表达阳性(73.8%);此外,20例正常肺支气管上皮细胞CD46表达均为阳性,19例正常肺泡上皮细胞CD46表达均为阴性。结论:CD46表达与非小细胞肺癌的病理组织类型及肿瘤细胞的起源有关,与肺癌的TNM分期无关。

不同浓度CD46预先给药对鼠原代培养小胶质细胞补体蛋白表达的影响

目的评价不同浓度CD46预先给药对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的鼠原代小胶质细胞补体蛋白表达的影响。方法培养原代小胶质细胞,取分离纯化的小胶质细胞接种于24孔板,随机分为4组(n=6):正常对照组、LPS组、低浓度CD46组和高浓度CD46组。采用噻唑蓝法检测细胞活性,采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定培养上清液补体C3浓度。结果 LPS组、低浓度CD46组、高浓度CD46组补体C3表达均较正常对照组增加(P<0.01);低浓度CD46组、高浓度CD46组补体C3表达均较LPS组减少,且高浓度CD46组补体C3表达较低浓度CD46组减少(P<0.05)。结论 CD46可明显抑制LPS诱导的小胶质细胞激活,显著减少补体C3释放。

变应性鼻炎大鼠鼻黏膜中补体调节蛋白C_1-INH和CD46的表达

目的:检测补体调节蛋白C1-INH和CD46在变应性鼻炎大鼠鼻黏膜中的表达水平,探讨其参与变应性鼻炎病理过程的可能机制。方法:9只SD大鼠以0.1%卵清蛋白辅以氢氧化铝佐剂进行基础致敏,继之鼻部激发建立大鼠变应性鼻炎模型(AR组),另9只以生理盐水代替0.1%卵清蛋白作为对照组(N组)。取大鼠呼吸区鼻黏膜,采用Western印迹法检测组织中补体调节蛋白C1-INH和CD46的表达含量,进行对比。结果:Western印迹结果显示两组大鼠C1-INH和CD46均阳性表达,而AR组大鼠鼻黏膜中C1-INH表达低于N组(P<0.05),CD46表达则高于N组,差异显著(P<0.01)。结论:补体调节蛋白CD46和C1-INH可能参与了变应性鼻炎的病理过程,其调控作用可能与补体激活的经典途径有关。

牛病毒性腹泻病毒感染对CD46基因修饰树突状细胞表型及其细胞因子分泌的影响

为研究CD46分子在BVDV感染树突状细胞(DC)介导的免疫应答中的作用,本研究根据牛CD46基因保守序列设计3对短发卡RNA(shRNA)的正义、反义寡核苷酸链,以及3对乱序列作为阴性对照,将其退火后分别克隆至p LL3.7质粒载体中,获得CD46基因shRNA重组质粒后将其转染MDBK细胞。采用荧光定量PCR和western blot技术筛选最佳沉默CD46基因的shRNA重组质粒,将其和表达载体p VAX1-CD46转染新疆褐牛DC(MDDCs)后利用BVDV感染MDDCs,通过荧光定量PCR检测DC表型及其细胞因子mRNA转录水平。结果显示,与未转染细胞组相比,CD46基因过表达的MDDCs中CD40、CD80、CD86和MHC-II的mRNA转录水平均明显升高(p<0.05);而CD46基因沉默的MDDCs中CD40 mRNA转录水平也明显升高(p<0.05),CD86 mRNA转录水平变化不明显(p>0.05),CD80和MHC-II的mRNA转录水平均明显下降(p<0.05)。与未转染细胞组相比,CD46基因过表达组IL-10和IL-12 mRNA转录水平变化不明显(p>0.05),而CD46基因沉默的MDDCs中IL-10和IL-12 mRNA的表达均明显下降(p<0.05)。本研究从新的角度初步揭示了CD46分子对BVDV感染DC成熟、初始T细胞增殖和分化的影响,为解决DCs对BVDV的免疫抑制作用提供新的思路。

非小细胞肺癌中CAR和CD46的表达及临床意义

目的研究柯萨奇-腺病毒受体(Coxsackie and adenovirus receptor,CAR)及B组腺病毒受体CD46分子在人非小细胞肺癌(Non-small cell lung carcinoma,NSCLC)组织中的表达水平及临床意义。方法免疫组织化学方法检测144例NSCLC组织中CAR、CD46的表达,对两者的表达水平与腺病毒的转染效率以及肺癌发生、发展之间的关系进行分析。结果 144例NSCLC组织中,CAR在肺鳞癌和肺腺癌中CAR的阳性表达率分别为77.5%(31/40)和36.8%(14/38);CD46则分别为58.3%(14/24)和88.1%(37/42);不同病理类型NSCLC组织中,CAR和CD46的表达模式明显不同(P<0.05)。此外,CAR表达与NSCLC临床TNM分期密切相关。30例TNMⅠ期患者中,13例CAR表达阳性(43.3%),48例Ⅱ～Ⅲ期患者中,32例CAR表达阳性(66.7%),Ⅱ～Ⅲ期患者的CAR阳性表达率明显高于Ⅰ期患者(P<0.05)。结论 CAR及CD46在NSCLC中的表达水平明显不同,鳞癌普遍高表达CAR,腺癌则有CD46的高表达,提示依赖不同受体的腺病毒对NSCLC的基因转移效率也有所不同;CAR表达水平可能是判断NSCLC预后的有用指标。

猫创伤性ALI和ARDS中CD_(59)和CD_(46)的表达和意义

目的 观察补体调节蛋白 CD5 9和 CD46 在创伤性急性肺损伤 ( AL I)和急性呼吸窘迫综合征 ( ARDS)动物肺组织中的表达变化 ,并探讨其在 AL I和 ARDS发病机制中的意义 .方法 采用右胸撞击建立创伤性 AL I和 ARDS模型 .用免疫组化和原位杂交技术检查 AL I和 ARDS家猫肺组织中 CD5 9,CD46 的表达情况 .结果 伤后 12 h AL I动物肺组织中 CD5 9,CD46 表达上调 ,2 4h最为明显 ,48～ 72 h减弱 .ARDS动物肺组织中 CD5 9,CD46 表达明显下调 .结论 伤后早期 ,CD5 9,CD46 表达上调 ,加强了组织细胞对补体攻击的自我保护机制 ;ARDS时 ,CD5 9,CD46 表达下调可能是炎性损伤加重的原因之一 .

补体调节蛋白CD46对CD4^＋T细胞的免疫调控

目的:探讨CD46分子对CD4+T细胞的免疫调控作用及其机制。方法:分离人CD4+T淋巴细胞,体外检测CD3、ConA、CD3/CD28、CD3/CD46、CD3/CD28/CD46共刺激对CD4+T细胞的作用效果,并检测其细胞上清液中白细胞介素-2(IL-2)、γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-10(IL-10)和转化生长因子-β(TGF-β)的水平。结果:与CD3组或阴性对照组相比,ConA、CD3/CD28、CD3/CD46和CD3/CD28/CD46共刺激后,CD4+T细胞均出现显著增殖反应(P<0.05),而且CD3/CD28/CD46共刺激组的增殖活性较CD3/CD28或CD3/CD46共刺激组显著增高(P<0.05)。CD3/CD28共刺激后,IL-2和IFN-γ水平较阴性对照组和CD3组显著升高(P<0.05),CD3/CD46共刺激后,IL-10和TGF-β水平较阴性对照组、ConA组、CD3组和CD3/CD28共刺激组显著升高(P<0.05)。结论:补体调节蛋白CD46可以诱导CD4+T细胞的增殖反应并产生IL-10和TGF-β,有可能抑制同种移植免疫反应。

CD46在小鼠脑缺血再灌注损伤中的表达和意义

目的观察补体调节蛋白CD46在小鼠脑缺血．再灌注损伤过程中的表达变化情况，探讨其在脑缺血-再灌注损伤中的可能意义。方法采用线栓法制备小鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型，缺血1h后再灌注。记录脑组织病理的动态变化，应用免疫荧光组织化学法及荧光定量PCR法检测脑内补体调节蛋白CD46的表达变化。结果脑组织病理损伤在再灌注后24h达最重，脑内补体调节蛋白CD46的表达水平逐渐减少，至再灌注后24h达最低，再灌注96h基本恢复正常。补体调节蛋白CD46表达水平与脑组织病理损伤呈负相关。结论脑缺血-再灌注后补体调节蛋CD46的表达水平发生显著变化，推测其可能参与脑缺血-再灌注后的免疫损伤过程，通过调节补体调节蛋nCD46的激活可为治疗脑缺血-再灌注损伤提供参考。

新辅助化疗对进展期乳腺癌患者 CD46表达影响及临床预后预测意义的研究

目的：探讨CD46在进展期浸润性乳腺癌及正常乳腺组织中的表达水平，并分析其与乳腺癌患者新辅助化疗疗效的关系，探讨其在乳腺癌新辅助化疗预后评估方面的预测价值。方法采用免疫组化的方法检测60例浸润性乳腺癌组织及30例正常乳腺组织标本CD46的表达，并分析该表达与新辅助化疗疗效的关系，采用生存分析预测CD46表达对患者预后的意义。结果乳腺癌组织CD46阳性率明显高于正常乳腺组织（81．67％vs．46．67％，P＜0．05）；新辅助化疗后，CD46表达阳性率明显下降（P＜0．05），CD46表达阳性率与患者化疗疗效呈负相关关系（P＜0．05）；CD46阳性表达提示患者的生存预后较差，浸润程度、有无淋巴结转移、CD46表达是乳腺癌新辅助化疗技术有效与否的独立影响因素（ P＜0．05）。结论乳腺癌患者的CD46表达高于健康者，与新辅助化疗技术的临床疗效呈负相关，CD46阳性表达率升高对患者较差的预后具有一定的预测价值。

CD3/CD46共刺激通路调控同种移植免疫反应的实验研究

目的:探讨CD3/CD46共刺激通路对同种移植免疫反应的调控作用及其机制。方法:分离转人CD46的C57BL/6小鼠的脾脏淋巴细胞,采用MACS免疫磁珠分选CD4+T细胞,以阴性对照组作为对照,体外检测CD3、ConA、CD3/CD28、CD3/CD46、CD3/CD28/CD46共刺激对CD4+T细胞增殖的作用效果,并检测其细胞上清液中白细胞介素2(IL-2),γ-干扰素(γ-IFN),白细胞介素10(IL-10)和转化生长因子β(TGFβ-)的水平,并以BALB/c小鼠的脾细胞作为刺激细胞,以转人CD46的C57BL/6小鼠的淋巴细胞作为反应细胞进行同种混合淋巴细胞培养,MMT法检测淋巴细胞增殖活性。结果:与CD3组或阴性对照组相比,ConA、CD3/CD28、CD3/CD46和CD3/CD28/CD46共刺激后,CD4+T细胞均出现显著增殖反应(P<0.05),而且CD3/CD28/CD46共刺激组的增殖活性较CD3/CD28或CD3/CD46共刺激组显著增高(P<0.05)。CD3/CD28共刺激后,IL-2和γ-IFN水平较阴性对照组和CD3组显著升高(P<0.05),CD3/CD46共刺激后,IL-10和TGFβ-水平较阴性对照组、ConA组、CD3组和CD3/CD28共刺激组显著升高(P<0.05)。CD3/CD46共刺激后可以显著地抑制同种混合淋巴细胞的增殖反应(P<0.05)。结论:CD3/CD46共刺激通路可以诱导CD4+T细胞产生IL-10和TGFβ-,抑制同种移植免疫反应的发生。

淋病奈瑟菌对hCD46基因转染COS-1细胞的黏附

为研究人CD46(hCD46)在菌毛介导的淋病奈瑟菌宿主特异性黏附过程中的作用。用连接PCR技术扩增出启动子与cDNA相连的hCD46小基因,并将其置换出pcDNA3.1载体中的CMV启动子,构建成重组真核表达载体pCD46。转染COS-1细胞后用间接免疫荧光法检测到hCD46cDNA在其自身启动子的指导下可在COS-1细胞膜表面有效表达,Western blotting检测表明表达产物的分子量正确,用流式细胞术分选表达hCD46的基因转染细胞COS-1-46。细菌黏附实验显示菌毛阳性淋病奈瑟菌临床分离株对COS-1-46细胞有较强的黏附性。提示hCD46是菌毛介导的淋病奈瑟菌特异性黏附于人黏膜细胞的一种重要受体,hCD46小基因可用于淋病奈瑟菌感染转基因小鼠模型的制备。

乳腺癌患者手术治疗前后血清CD_(46)水平检测及临床意义

目的研究乳腺癌患者手术治疗前后血清CD46水平检测及临床意义。方法应用ELISA法对58例乳腺癌患者(实验组)进行手术治疗前后CD46水平的检测,并与30例正常对照组进行对比。结果实验组术前血清CD46显著高于对照组,术后CD46水平较术前显著下降(P<0.05)。术后复发患者术前及术后CD46变化差值显著高于非复发组,并与患者无病生存期呈正相关(r=0.57,P<0.05)。结论检测乳腺癌患者手术前后血清CD46水平变化可作为诊断及预后的预测参数。

CD46、Nectin-4在麻疹病毒感染人肺泡上皮细胞中的作用

目的:探讨CD46、Nectin-4在麻疹病毒感染人肺泡上皮细胞中的作用。以及CD46和Nectin-4之间的相互作用。方法:分为麻疹病毒感染前处理组和感染后2 h组,均用抗CD46抗体、抗Nectin-4抗体处理人肺泡上皮细胞,并设对照组。检测细胞内病毒滴度的变化,采用Western blot和Real-time PCR检测NP蛋白的表达水平,并运用免疫共沉淀检测CD46与Nectin-4的相互作用。结果:与对照组相比,麻疹病毒感染前用抗CD46抗体、抗Nectin-4抗体处理的人肺泡上皮细胞内麻疹病毒滴度显著降低,分别为对照组的48.03%和49.53%,同时用抗CD46抗体、抗Nectin-4抗体处理使病毒滴度下降为27.15%,差异均有统计学意义(P<0.01)。然而,在麻疹病毒感染2 h后用抗CD46抗体、抗Nectin-4抗体处理,人肺泡上皮细胞内麻疹病毒滴度和NP蛋白量未见显著减少。Western blot和Real-time PCR结果与上述结果一致;免疫共沉淀实验显示,CD46与Nectin-4存在相互作用。结论:CD46、Nectin-4在麻疹病毒感染肺泡上皮细胞中起到介导作用,CD46与Nectin-4可能存在协同作用,该作用对麻疹病毒的感染起到了增强效果。