CD/5-FC系统对结肠癌细胞的杀伤作用

目的:探讨组织特异性胞嘧啶脱氨基酶(cytosinedeaminase,CD)/5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine,5-FC)系统对不同分泌癌胚抗原(carcinoembryonicantigen,CEA)的大肠癌细胞LoVo和SW480的靶向杀伤作用.方法:脂质体法将CEA基因顺式转录调控序列(TRS)驱动CD基因的组织特异性逆转录病毒载体G1CEACDNa及非组织特异性逆转录病毒载体pCD2分别转导入大肠癌细胞LoVo和SW480,以G418筛选阳性克隆扩增后给予前药5-FC进行敏感试验.结果:LoVo-CEACD及LoVo-CD比LoVo对5-FC的敏感性明显提高(P<0.01,t=5.688,n=9;P<0.01,t=3.136,n=9),SW480-CEACD及SW480-CD比SW480对5-FC的敏感性明显提高(P<0.01,t=3.437,n=9;P<0.01,t=3.516,n=9),LoVo-CEACD比LoVo-CD对5-FC的敏感性明显增强(P<0.05,t=2.183,n=9),而SW480-CEACD对5-FC的敏感性小于SW480-CD,SW480-CEACD对前药5-FC的敏感性低于LoVo-CEACD(P<0.05,t=2.504,n=9),转CD基因之LoVo和SW480细胞体外实验均可观察到明显的旁观者效应.结论:组织特异性CD/5-FC系统对LoVo和SW480细胞均有明显的靶向杀伤效果,但对SW480细胞的杀伤作用小于LoVo细胞.

CD/5-FC系统对小鼠胃癌细胞杀伤作用的研究

目的 探讨CD5-FC自杀基因系统对小鼠胃癌细胞的体外杀伤作用及其机制。方法以逆转录病毒载体介导CD基因转导小鼠胃癌细胞株MFC,采用MTT法测定CD5-FC系统的体外杀伤作用及其“旁观者”效应;利用Hoechst33258荧光染色法、琼脂糖凝胶电泳法检测凋亡细胞,同时采用半定量RT-PCR技术检测凋亡相关基因的表达。结果转导CD基因可使MFC对5-FC高度敏感,并且显示出强大的“旁观者”效应。经5-FC作用后,荧光染色可见到典型的凋亡细胞核形态学改变,琼脂糖凝胶电泳出现典型的DNA梯度,同时发现凋亡相关基因bcl-2基因表达下调,而bax与caspase-3基因表达上调。结论CD5-FC自杀基因系统对小鼠胃癌细胞MFC具有强大的杀伤作用。

腺病毒介导CD/5-FC系统治疗口腔鳞癌机制的研究

目的 :研究腺病毒介导的大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因 (AdCMVCD) /5 氟胞嘧啶 (5 FC)自杀基因治疗口腔鳞癌的作用机制。方法 :AdCMVCD/5 FC系统治疗口腔鳞癌细胞 (Tca8113细胞株 )后分别应用3 H TdR掺入法、流式细胞仪 (FCM )、TUNEL法和透射电镜等方法进行检测。结果 :与对照组比较 ,CD/5 FC治疗组3 H TdR掺入率显著下降 (P <0 .0 0 1) ,且与 5 FC的浓度成反比 ;FCM显示S期比率显著升高 (P <0 .0 0 1) ,G2 +M期比率下降为 0 (P <0 .0 0 1) ,G1/G0 期的改变不明显 (P >0 .0 5 ) ;透射电镜及TUNEL法显示治疗后可观察到明显的细胞凋亡 ,其凋亡率由治疗前的 (4 .40± 0 .87) %上升到 (15 .80± 1.5 5 ) % (P <0 .0 0 1)。结论 :AdCMVCD/5 FC系统对口腔鳞癌细胞的杀伤作用可能通过抑制DNA的合成。

CD/5-FC对KSHV肿瘤转化基因K12诱导NIH3T3转化细胞的杀伤作用

采用分子克隆技术构建含卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi′ssarcoma-associatedherpesvirus,KSHV)转化基因K12和含胞嘧啶脱氨酶(CD)基因重组逆转录病毒表达质粒,分别命名为LZRS-K12和pLXSN-Fcy∷Fur。将LZRS-K12质粒转染NIH3T3细胞系,诱导细胞转化获得具有肿瘤细胞生物学特性的N/K12细胞,进一步将pLXSN-Fcy∷Fur质粒转染N/K12细胞,获得含CD基因的N/K12/FF细胞。加入5-氟胞嘧啶(5-FC)后,采用MTT法、流式细胞仪和免疫组化(IHC)等方法,分别检测细胞存活率、凋亡率及凋亡相关蛋白的表达。结果显示,N/K12/FF细胞在使用5-FC后存活率明显下降。流式细胞仪检测结果显示,5-FC作用后的N/K12/FF细胞的凋亡率与作用前相比增加了4.6%。与此同时,经5-FC作用后的N/K12和N/K12/FF细胞的生长周期发生了明显变化,均表现为G0-G1期细胞比率降低,S和G2-M期细胞比率增高。5-FC使得N/K12细胞的增殖主要阻滞在G2-M期,而N/K12/FF细胞的增殖主要阻滞在S期。IHC检测结果表明,N/K12细胞在5-FC使用前后Fas和Fas-L表达改变均不明显;而N/K12/FF细胞在5-FC使用后的Fas和Fas-L表达水平均明显高于5-FC使用前的水平。提示,CD/5-FC对KSHV肿瘤转化基因K12诱导NIH3T3转化细胞具有杀伤作用;凋亡有可能介导了部分杀伤过程;Fas和Fas-L有可能部分参与凋亡的诱导。

携带CD自杀基因NDV重组病毒对小鼠肝癌细胞转移模型的治疗效果

采用反向遗传操作技术构建新城疫病毒基因组NP/P 位点表达胞嘧啶脱氨酶(Cytosine deaminase,CD)基因弱毒力重组新城疫病毒rClone30-CD和中毒力重组新城疫病毒rAnhinga-CD。MTT检测结果表明,在协同5-氟胞嘧啶(5-Fluorocytosine,5-FC)条件下,两株重组新城疫病毒可在体外有效杀伤人肝癌细胞HepG2。通过Balb/c鼠尾静脉注射小鼠肝癌细胞H22构建小鼠肝癌细胞转移模型,经重组病毒协同5-FC联合治疗,荷瘤小鼠转移肿瘤体积显著缩小、肿瘤组织出现明显凋亡与坏死。体内试验结果表明,中毒力重组新城疫病毒rAnhinga-CD抑瘤效果优于弱毒力重组新城疫病毒rClone30-CD。

YCD/5-FC自杀基因治疗系统对K562B白血病细胞杀伤作用的小鼠体内实验研究

目的 了解酵母菌胞嘧啶脱氨酶 5 氟胞嘧啶 (YCD 5 FC)系统在体内对转基因高致瘤性K5 6 2细胞 (K5 6 2B细胞 )的杀伤效应。方法 以高滴度逆转录病毒转染K5 6 2B细胞并筛选出阳性转染克隆YCD K5 6 2B ;12只SCID小鼠分为治疗及对照组 ,在小鼠左右两侧近前肢处腹部皮下注射YCD K5 6 2B及K5 6 2B细胞 ,成瘤后治疗组腹腔注射 5 0 0mg kg 5 FC共 10d ,对照组腹腔注射生理盐水 ,观察瘤体相对体积变化及病理变化。结果 瘤细胞接种第 2 1天 ,瘤体相对体积分别为 :YCD K5 6 2B +5 FC组 2 .92 2± 0 .5 81,YCD K5 6 2B +生理盐水组 2 4.434± 4.790 ,K5 6 2B +5 FC组 2 2 .70 1± 2 35 0 ,K5 6 2B +生理盐水组 2 4.46 0± 1.6 70 ;YCD K5 6 2B +5 FC组与YCD K5 6 2B +生理盐水组相比差异非常显著 (P =0 0 0 0 1) ,K5 6 2B +5 FC组及K5 6 2B +生理盐水组相比 ,差异无显著性 (P =0 .0 96 ) ,表明 5 FC对转YCD基因的K5 6 2B白血病细胞有明显的杀伤效应 ,而对未转基因细胞的生长无影响 ;YCD K5 6 2B +5 FC组瘤体于瘤细胞接种后第 12～第 15天 (5 FC治疗的第 3～第 6天 )有所缩小 (最小的相对体积为 0 .6 81) ,病理检查可见 5 FC治疗组瘤体有以小动脉血管为中心的坏死。结论 YCD 5

CD／5-FC自杀基因前药系统的研究进展

自杀基因前药系统是目前肿瘤基因治疗中的研究热点。其中CD/5-FC自杀基因前药系统是目前研究最多、进展最快的自杀基因系统之一。它对肿瘤细胞的杀死机制除了通过直接毒性作用和旁观者效应以外,还包括自杀基因联合使用、免疫细胞和免疫调节因子的参与、自杀基因与放射治疗联合作用等。本文就CD/5-F自杀基因前药系统的分子生物学基础、抗癌机制以及其在临床实验中面临的问题等研究进展进行综述。

CD/5-FC系统对胰腺癌裸鼠移植瘤的抗血管形成作用的初步探讨

目的 探讨自杀基因系统对胰腺癌裸鼠移植瘤的微血管形成的抑制作用。方法 构建含大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶 (cytosinedeaminase ,CD)基因的腺病毒穿梭载体 pAdTrack CMV CD ,与骨架载体pAdEasy 1在细菌内重组为 pAd CD ,经 2 93细胞包装、扩增 ,氯化铯密度梯度离心制备纯化高效的CD腺病毒液 ,建立胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型 ,观察CD基因的原位治疗及微血管形成抑制情况。结果 含CD基因腺病毒载体经酶切鉴定正确 ,包装纯化后 ,检测病毒滴度为 2× 10 11pfu/ml,体内实验显示CD基因原位转导对裸鼠胰腺癌移植瘤的微血管形成具有较明显的抑制效应。结论 腺病毒介导CD/ 5 FC自杀基因系统 ,不仅可以直接杀灭癌细胞 ,而且还可通过抑制移植瘤微血管的形成来抑制胰腺癌细胞的生长 ,可作为胰腺癌基因治疗的有效方法。

自杀基因治疗胰腺癌的研究

胰腺癌是常见恶性肿瘤之一,且隐匿而不易被早期发现,中晚期患者对化疗与放射治疗的敏感性差,肿瘤基因治疗己成为恶性肿瘤治疗研究的热点之一。目前常用的自杀基因CD/5-FC、HSV-TK/GCV、CD/UPRT等均取得重大进展,但要应用于临床则需进一步研究。

PNP—CD融合自杀基因系统对肝癌细胞杀伤作用的实验研究

目的分析PNP—CD融合自杀基因系统对肝癌细胞HepG2的杀伤作用并探讨其可能的机制。方法利用重组PCR定点诱变法制备融合基因PNP—CD。将PNP—CD插入真核表达载体pcDNA3．O中，构建融合自杀基因表达载体pcDNA3．0／PNP—CD。经酶切、PCR及测序鉴定重组体，G418筛选获得稳定转染pcDNA3．0／PNP—CD的抗性细胞克隆。用RTPCR和Western Blotting法检测PNPCD基因在HepG2细胞中的表达。用台盼蓝排斥法检测细胞生长曲线，用MTT法检测细胞细胞克隆对相应前药敏感性及所导致的旁观者效应。结果融合基因片段PNP—CD正确插入了pcDNA3．0中，pcDNA3．0／PNPCD在HepG2细胞中实现了表达。细胞抗性克隆对特定的前药高度敏感。在两种前药联合作用下，pcDNA3．0／PNP—CD所致旁观者效应明显强于只给予MeP—dR一种前药所致旁观者效应。结论具有双自杀基因功能的PNPCD融合基因系统是肝癌基因治疗中一种高效治疗载体，对肝癌细胞有着良好的杀伤作用。

胰、脾

联合应用双自杀基因对SW1990细胞的杀伤作用//逆转录病毒介导的CD／5-FC对胰腺癌细胞的杀伤作用//胰头癌淋巴结转移的临床研究//胰岛素瘤的诊断与治疗//高强度聚焦超声治疗晚期胰腺癌//常规分村立体定向适形放射治疗晚期胰腺癌28例临床观察//^125I种子檀入内照射联合化疗治疗胰腺癌临床疗效的初步评价。

自杀基因联合放射对食管癌细胞株的实验研究

目的自杀基因具有能将无细胞毒性的前体药物转化为有细胞毒性作用的药物而使细胞死亡,通过观察大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶/氟胞嘧啶(CD/5-FC)自杀基因系统对食管癌EC109细胞杀伤效应及与放射联合应用对食管癌肿瘤细胞协同杀伤效应。方法采用PCR方法从大肠杆菌基因组DNA中扩增出CD基因;构建重组真核载体pcDNA3.1-CD;用脂质体转染法转染EC109细胞;观察CD/5-FC体系对EC109细胞的杀伤效应和旁观者效应及对放射的增敏效应。结果RT-PCR分析结果表明CD基因已转入EC109细胞并表达。离体实验证实5-FC对转CD基因后的食管癌细胞株有明显的细胞毒作用,含5%的转基因食管癌细胞加入5-FC后的细胞存活比率为41.8%±14.2%,低于对照组的94.6%±4.3%结果(t=3.14,P<0.05);加入10%的转基因细胞的存活比率为37.8%±4.4%,低于对照组的95.6%±5.4%结果(t=9.75,P<0.01)。CD/5-FC体系对肿瘤细胞放射增敏效果明显,加前药5-FC及放射组细胞存活曲线低于单纯加前药5-FC对照组或单纯放射对照组,重复测量数据方差分析结果显示F=11.50,P<0.01;治疗组分别与5-FC对照组及单纯放射对照组相比F值分别为4.11、10.53,P值分别<0.05、0.01。结论CD/5-FC体系的旁观者效应和放射增敏效果明显。

腺病毒介导CD—TK融合基因对肾癌细胞的杀伤作用

肾癌是常见的泌尿系肿瘤，发病率仅次于膀胱肿瘤。自杀基因治疗在晚期肿瘤的综合治疗中发挥了重要作用。单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV—TK）基因／无环鸟昔（GCV）及大肠杆菌胞嘧啶脱胺酶（CD）基因／5-氟胞嘧啶（5-FC）系统治疗机制不同，联合可产生协同效应。本研究旨在探讨联合TK／GCV、CD／5-FC系统在肾癌治疗中的价值。

VP22-CD基因工程化载体对胶质瘤细胞体外杀伤作用的研究

目的构建CD以及VP22-CD基因工程化载体，并探讨其在体外对胶质瘤细胞的杀伤作用。方法利用聚合酶链式反应（PCR）得到CD以及VP22基因片段；利用In—fusion基因克隆方法将得到的基因片段插入到pEGFP—N1载体中，构建CD以及VP22-CD基因工程化载体；利用脂质体转染的方法将构建的基因工程化载体转染到胶质瘤细胞c6及U87细胞中，并通过体外光镜及荧光显微镜观察转染率；利用MTT比色法评价加入前药5-氟胞嘧啶后对转染后胶质瘤细胞的杀伤率。结果（1）将CD基因或VP22-CD融合基因插入到pEGFP—CD载体中，构建得到pEGFP—CD以及pEGFP—VP22-CD载体。（2）pEGFP—CD及pEGFP—VP22-CD载体可转染入c6或U87胶质瘤细胞，转染率分别为2．5％和3．7％以及2．0％和4．1％。（3）在c6或U87细胞中转染pEGFP—CD或pEGFP-VP22．CD载体并加入前药5．氟胞嘧啶后，细胞的存活率分别为（30．36±0．63）％和（11．75±1．01）％以及（28．78±3．62）％和（18．26±2．27）％，与转染pEGFP—N1组相比差异均有统计学意义（均P〈0．05）。（4）在C6或U87细胞中加入前药5-氟胞嘧啶后，转染pEGFP—VP22-CD组与转染pEGFP—CD组相比差异均有统计学意义（均P〈0．05）。结论CD／5-FC系统在体外对恶性胶质瘤细胞具有显著的杀伤作用和旁观者效应；并且穿梭蛋白VP22可进一步促进系统对细胞的杀伤作用。

^(131)I-c(RGD)_2环肽及其联合基因治疗对荷神经胶质瘤裸鼠模型肿瘤抑制作用

[目的]探讨^(131)I标记的c(RGD)_2 对荷神经胶质瘤裸鼠模型的治疗作用,并与放射敏感性启动子E8和CD/5-FC自杀药物系统进行联合治疗,拟建立一种具有特异性和高效性的恶性肿瘤靶向治疗方式。[方法]建立荷神经胶质瘤U87裸鼠模型30只,瘤体直径约14mm时,随机分为6组,每组5只:(1)生理盐水组;(2)^(131)I-c(RGD)_2 11.1MBq组;(3)^(131)I-c(RGD)_2 18.5MBq;(4)^(131)I-c(RGD)_2 18.5MBq+LV组:连续2d,瘤体内注射方式将5×106U/25μl的重组慢病组载体E8-cod A-GFP LV转染至肿瘤,然后通过尾静脉将18.5MBq^(131)I-c(RGD)_2 注入到小鼠体内;(5)^(131)I-c(RGD)_2 18.5MBq+LV+5-FC组:同(4),将同量慢病毒载体转染至瘤内,同时腹腔注射10 mg前体药物5-FC连续7d。(6)^(131)I-对照肽18.5MBq组(序列:YKAREC)。观察各组裸瘤肿瘤体积和质量的变化。[结果]治疗结束后,(2)、(3)、(4)、(5)、(6)组抑瘤率分别为36.75%、41.39%、43.63%、44.87%、3.31%。对瘤体质量进行比较,只有生理盐水组与(3)、(4)及(5)组之间差异有统计学意义(P<0.05),而(3)、(4)及(5)组之间差异无统计学意义(P>0.05)。[结论]^(131)I-c(RGD)_2 能抑制U87神经胶质瘤的生长,对神经胶质瘤的治疗有潜在价值。但^(131)I-c(RGD)_2 联合放射敏感性启动子E8和CD/5-FC自杀系统对于肿瘤细胞的治疗并没有达到统计学上的预期的效果,可能与开始治疗时的瘤体积过大或者样本量小有关。