结核特异性CD4^+ α/β TCR四聚体细胞株筛选技术的建立和应用

目的应用不同的MTB多肽以及不同的HLA-DR基因构建的膜表面表达结核抗原肽/HLA-DR复合物的S2恒定细胞株,即人工APC筛选、鉴定结核特异性CD4+α/βTCR四聚体。方法以PE标记的CD4+α/βTCR四聚体、FITC标记的抗HLA-DR抗体(L243),分别与未诱导表达或CuSO4诱导表达后的膜表面表达结核抗原肽/HLA-DR的果蝇S2恒定细胞株,以及与无多肽或结合有结核多肽的、表达HLA-DR的S2细胞株共孵育,流式细胞技术检测分析TCR四聚体与各种细胞株结合率的差异。结果 TCR四聚体6M、6N均与2#细胞株,即C5/HLA-DRB1*0404(1.73%、5.93%)等具有较高的阳性结合率;结核抗原肽孵育后,一些人工APC的四聚体阳性结合率有所提高;所筛选的9个TCR四聚体均与2#细胞株有较高的结合率。结论膜表达结核抗原肽/HLA-DR的S2细胞株,可以应用于结核特异性CD4+α/βTCR四聚体的筛选、鉴定;构建的9个CD4+α/βTCR四聚体均为结核特异性。

应用CD4^+TCR四聚体-流式分析和细胞爬片法检测分析外周血结核抗原特异性CD14^+单核细胞

目的探讨CD4+TCR四聚体-流式分析和细胞爬片法检测分析外周血结核抗原特异性CD14+单核细胞的应用价值。方法应用四聚体对肺结核患者(肺结核组)外周血进行染色,流式检测四聚体阳性CD14+细胞的百分率,以非结核呼吸道感染患者(非结核呼吸道感染组)外周血及脐带血标本(脐带血组)作为研究对照。将肺结核组和对照组外周血制作成细胞爬片,用四聚体-细胞爬片法原位染色,激光共聚焦倒置显微镜观察细胞爬片中四聚体与结核抗原双染阳性及四聚体与CD14双染阳性细胞的分布情况。结果应用CD4+Vα21-J39/Vβ29-D1-J2 TCR四聚体检测肺结核组、非结核呼吸道感染组和脐带血组的四聚体阳性CD14+细胞百分率中位数分别为1.32%、0.50%和0.26%,而CD4+Vα21-J39/Vβ29-D2-J2 TCR四聚体则分别为1.05%、0.49%和0.19%。肺结核组外周血CD14+单核细胞百分率显著高于各对照组。细胞爬片法可观察到肺结核组四聚体与CD14双染阳性及四聚体与结核抗原双染阳性的细胞,而对照组标本均为阴性。结论 CD4+TCR四聚体技术,结合细胞流式和细胞爬片原位染色方法,能在体外敏感地检测出结核抗原特异性CD14+单核细胞,可以更准确地评价其在结核感染者体内的变化特征及临床意义。

MHC-肽四聚体的研究进展

四聚体技术是一种可直接对抗原特异的T淋巴细胞进行标记的新方法。MHC-肽四聚体可被用于抗原特异的T细胞的表位分析,T细胞的直接分离与克隆,T细胞功能检测以及作为激活T细胞的刺激物和进行原位染色等方面的研究。

TCRαβ^+CD4^+CD8^-胸腺髓质细胞的表型分析

本实验综合分析了CD4^+CD8^-胸腺髓质细胞多种表面分子的表达情况。通过抗体加补体的2次杀伤和panning方法,分离出CD4^+CD8^-胸腺髓质细胞,进行直接或间接荧光抗体染色,利用流式细胞仪分析细胞表型。发现CD4^+CD8^-胸腺细胞均为TCRαβ阳性,但CD69,HSA,Qa-2,3G11,6C10分子呈现异质性表达。利用多个表面分子组合进行双染FACS分析,推测CD4SP胸腺细胞由不成熟到发育成熟,迁出胸腺,可分为7个阶段:(1)3G11^-6C10^+CD69^+HSA^(hi),(2)3G11^+6C10^+CD69^+HSA^(hi),(3)3G11^+6C10^-CD69^+HSA^(int),(4)3G11^+6C10^-CD69^-HSA^(int)Qa-2^-,(5)3G11^+HSA^(lo/-)Qa-2^(lo),4阶段还可进一步分化为(6) 3G11^-HSA^(lo)Qa-2^-,(7) 3G11^-HSA^(lo/-)Qa-2^(hi)。Qa-2^+的5,7两阶段细胞已达到最终成熟,并可迁出胸腺。

利用γδ TCR四聚体检测分析外周血中CD14+CD277+单核-巨噬细胞的比例及其与治疗转归的关系

目的 探讨外周血中CD14+单核-巨噬细胞在γδ T细胞识别磷酸化抗原中的作用及其与治疗转归的关系.方法 应用3种γδ TCR四聚体对肺结核患者外周血和新生儿脐带血单个核细胞进行流式染色,分析各类抗原提呈细胞( APC)所占比例,根据临床病例分析其与治疗转归的关系.结果 在结核患者外周血和脐带血中同时与CD277抗体、γδ TCR四聚体结合比例最大且结合力最强的细胞是CD14+单核-巨噬细胞,其百分率中位数( P50)值在抗结核治疗1个月时达到最高峰值,综合临床病症结果显示该时段患者病情明显好转.结论 CD14+单核-巨噬细胞在γδ T细胞识别磷酸化抗原的各类提呈细胞群中所占比例最大,为深入探讨γδ T细胞限制性识别磷酸化抗原机制及同时参与固有免疫与适应性免疫提供了实验资料.

pMHC多聚体技术研究进展

抗原肽结合的主要组织相容性复合物(pMHC)通过形成多聚体可有效提高结合到位于T细胞表面上的T细胞受体(TCR)的亲合力。自从20年前pMHC四聚体首次被用于抗原特异性T细胞检测以来,pMHC四聚体已成为免疫分析中最重要的检测工具之一。近年来pMHC多聚体在四聚体的基础上又取得了较大进展,更高价的pMHC多聚体被研制出来以提高免疫检测的灵敏度;可逆化的pMHC多聚体由于可以从T细胞表面解离而避免了对T细胞的功能损伤,也被发展用于抗原特异的T细胞分离。pMHC多聚体作为一类分子工具在抗原特异的T细胞分析和免疫治疗中具有重要作用,对它的充分了解和有效运用能帮助我们更好地进行科学和临床应用。

结核性胸膜炎胸水CD4^+与CD8^+ T细胞的TCR和CDR3谱型分析

本研究的目的是了解结核性胸膜炎患者胸水中CD4^＋、CD8^＋T细胞聚集情况，并建立高效、灵敏的TCRα和β链多重PCR扩增方法，扩增出其特异性CD4^＋、CD^＋T细胞的TCRα和β链全长编码序列，研究病变局部特异性克隆增殖TCR的重排特点以及CDR3（complementarity-determining region 3）谱型，可供构建结核分枝杆菌（Mtb）特异反应性TCR四聚体参考。

应用CD4＋Vα9-J27／Vβ29-D1-J2四聚体检测结核分枝杆菌感染的初步研究

目的初步探讨CD4＋Vα9-J27／V1329-D1-J2TCR四聚体对结核分枝杆菌感染检测的特异性。方法应用果蝇s2恒定细胞株表达、纯化获得生物素化TCR复合物单体制备四聚体。流式检测PE-四聚体与细胞株膜结核抗原肽／HLA-DR复合物以及肺结核患者外周血的单核细胞的结合百分率，并设立病例对照组。激光共聚焦倒置显微镜观察肺结核病理组织及对照组织中四聚体与结核抗原双染阳性的细胞及四聚体与CD14双染阳性细胞。结果四聚体对表达C14／HLA—DRB1＊1504的细胞株结合能力最强。四聚体与结核患者外周血单核细胞结合率显著高于各对照组。结核组织标本可观察到四聚体与CD14双染阳性及四聚体与结核抗原双染阳性的细胞；而对照组织均为阴性。结论CD4＋TCR四聚体对结核检测有一定的特异性，为TCR四聚体应用于结核的诊断和免疫机制研究提供了一定的实验资料。

结核分枝杆菌特异性CD4^＋α／βT细胞受体四聚体筛选细胞系的构建及检测

目的构建及应用结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）特异性CD4^＋α／βT细胞受体（TCR）四聚体筛选细胞系。方法从Mtb多肽阳性反应结核患者中，PCR扩增HLA-DRβ链，构建HLA—DRα链和加载有结核抗原肽的HLA—DR仅链全长基因的表达载体pMT—HLA—DRB及pMT-HLA—DRA—P，磷酸钙转染法转入果蝇S2（Schneider2）细胞中进行表达配对，细胞免疫组化法初步鉴定表达情况，并应用所建立细胞系以流式细胞术筛选Mtb特异性CD4^＋α／βTCR四聚体。结果细胞免疫组化法及流式细胞术鉴定显示获得细胞膜上表达结核抗原肽／HLA—DR复合物的稳定S2细胞株，并筛选出2种Mtb特异性CD4^＋α／βTCR四聚体。结论成功构建Mtb特异性CD4^＋α／βTCR四聚体筛选细胞系，为分析鉴定Mtb特异反应性TCR四聚体，探索开发结核诊断新方法及新型结核疫苗的研制提供了工具。