小鼠缺血性脑卒中后病灶部位CD45^(+)CD11b^(-)免疫细胞种类以及基因表达谱分析

目的探讨小鼠缺血性脑卒中发生后不同时间点病灶部位CD45^(+)CD11b^(-)免疫细胞浸润情况以及基因表达的动态变化。方法将60只6~8周龄成年雄性C57鼠采用随机数字表法分为6组:假手术组(Sham组)和缺血性脑卒中后第1天(D1L组)、第3天组(D3L组)、第7天组(D7L组)、第14天组(D14L组)和第21天组(D21L组)。Sham组小鼠给予缺血性脑卒中处理但不进行大脑中动脉结扎,缺血性脑卒中各组小鼠给予缺血性脑卒中手术处理。按上述时间点取病灶组织消化后,流式细胞术分选CD45^(+)CD11b^(-)免疫细胞,然后应用RNA-seq技术,对小鼠不同时间点分选的CD45^(+)CD11b^(-)免疫细胞进行基因表达谱测序、生物信息学分析以及细胞种类验证。结果在缺血性脑卒中发生后,γδT淋巴细胞和天然杀伤性T淋巴细胞的数目逐渐上升,在D3达到高峰,然后逐渐下降趋于稳定;CD4 T淋巴细胞和CD8 T淋巴细胞数目逐渐上升,在D14达到高峰;调节性T淋巴细胞数目在D14出现明显的上升。结论缺血性脑卒中发生后不同时间点,不同种类的CD45^(+)CD11b^(-)免疫细胞从外周循环系统浸润到病灶组织,早期主要以发挥先天免疫功能的CD45^(+)CD11b^(-)免疫细胞为主,中晚期主要以发挥适应性免疫的CD4 T淋巴细胞和CD8 T淋巴细胞为主。本研究首次运用转录组测序技术和流式细胞术系统阐述了缺血性脑卒中后不同时间点病灶部位CD45^(+)CD11b^(-)免疫细胞的浸润情况以及基因表达特点,为研究缺血性卒中发生、发展的分子机制提供基础。

ICAM-1、MMP-9及NF-κB在胆管癌中的表达及与外周血免疫抑制细胞的关系

目的探讨细胞间粘附分子-1(ICAM-1)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)及NF-κB在胆管癌中的表达及外周血中CD14^(+)CD11b^(+)HAL-DR^(-)髓源性抑制细胞(MDSC)的关系。方法选取昆明医科大学附属甘美医院2017年12月至2019年12月收治的胆管癌患者60例研究对象。采用免疫组化法测定胆管癌组织与癌旁正常组织ICAM-1蛋白、MMP-9蛋白及NF-κB蛋白;采用流式细胞术检测患者外周血中CD14^(+)CD11b^(+)HAL-DRMDSC比例。比较胆管癌组织与癌旁组织ICAM-1蛋白、MMP-9蛋白和NF-κB蛋白表达;不同病理特征ICAM-1蛋白、MMP-9蛋白和NF-κB蛋白表达及外周血中CD14^(+)CD11b^(+)HAL-DR^(-)MDSC比例;ICAM-1蛋白、MMP-9蛋白和NF-κB蛋白表达与外周血中CD14^(+)CD11b^(+)HAL-DR^(-)MDSC比例相关性。结果胆管癌组织ICAM-1蛋白、MMP-9蛋白和NF-κB蛋白表达阳性率均高于癌旁正常组(P<0.05)。不同性别、年龄、病理分级和淋巴结转移ICAM-1蛋白表达比较无明显差异(P>0.05);III~IV期ICAM-1蛋白表达阳性率高于I~II期(P<0.05)。不同性别、年龄、病理分级和临床分期MMP-9蛋白表达比较无明显差异(P>0.05);淋巴结转移MMP-9蛋白表达阳性率高于无淋巴结转移(P<0.05)。不同性别、年龄、病理分级和淋巴结转移NF-κB蛋白表达比较无明显差异(P>0.05);III~IV期NF-κB蛋白表达阳性率高于I~II期(P<0.05)。不同性别、年龄、病理分级和淋巴结转移CD14^(+)CD11b^(+)HAL-DR^(-)MDSC比例比较无明显差异(P>0.05);III~IV期CD14^(+)CD11b^(+)HAL-DR^(-)MDSC比例高于I~II期(P<0.05)。ICAM-1蛋白、MMP-9蛋白及NF-κB蛋白表达与CD14^(+)CD11b^(+)HAL-DR^(-)MDSC比例呈线性正相关。结论ICAM-1蛋白、MMP-9蛋白及NF-κB蛋白表在胆管癌中高表达,外周血中CD14^(+)CD11b^(+)HAL-DR^(-)MDSC比例升高,且ICAM-1蛋白、MMP-9蛋白及NF-κB蛋白表达与CD14^(+)CD11b^(+)HAL-DR^(-)MDSC比例呈线性正相关。

CD11b^+/CD66b^-表型髓系细胞在结肠癌进展和肝转移中的作用

目的探讨CD11b^+/CD66b^-表型髓系细胞与人类结肠癌进展和肝转移的关系。方法采用real-time PCR、Western blotting及免疫组化方法检测正常结肠组织、结肠癌组织及结肠癌肝转移组织中CD11b、趋化因子配体2(CCL2)和趋化因子受体2(CCR2)的转录水平、蛋白翻译水平。免疫共沉淀方法检测CCL2和CCR2间的相互结合关系。结果结肠癌组织、肝转移瘤组织的CD11b mRNA转录水平及蛋白的表达水平较癌旁正常组织高(P<0.05)。肝转移瘤组织中CCL2的mRNA转录水平及蛋白的表达水平明显高于癌旁正常结肠组织及结肠癌组织(P<0.05),而CCR2mRNA转录水平及蛋白表达水平在三者中无统计学差异(P>0.05)。趋化因子配体CCL2和趋化因子受体CCR2之间可相互结合。结论 CD11b表型髓系细胞在结肠癌组织及结肠癌肝转移组织中广泛浸润,并可能在CCL2-CCR2轴的介导下促进结肠癌进展和结肠癌肝转移。

参附注射液抑制HMGB1诱发的CD11b^+细胞麻痹对严重脓毒症内皮的保护作用

目的探讨严重脓毒症幼猪生化指标、肺部病理损伤与免疫机制间的相互关系,以及参附注射液的干预作用。方法将2~3月龄巴拿马香猪按随机数字表法分为假手术组(Sham组;静脉注射生理盐水)、脂多糖(LPS)致严重脓毒症模型组(LPS组;静脉注射LPS 1 mg/kg,0.5 mg·kg^-1·h^-1维持12 h)、参附注射液干预组(SF组;制模同时静脉注射参附注射液10 mL/kg,每日2次),每组5只。制模后48 h取血检测C-反应蛋白(CRP)、降钙素原(PCT)、氧合指数(PaO2/FiO2)、剩余碱(BE)、血乳酸(Lac)等生化指标;取外周血行流式细胞检测,分析中性粒细胞数目〔髓过氧化物酶阳性(MPO^+)〕及其激活亚群CD11b^+CD64^+、M1型巨噬细胞(CD80^+CD64^+)、CD4^+和CD8^+T细胞的变化;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血浆细胞因子水平;苏木素-伊红(HE)染色观察肺组织病理损伤;采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测肺组织损伤相关分子及其受体、趋化因子、炎性因子、血管内皮相关分子、紧密连接蛋白的mRNA表达。结果与Sham组比较,LPS组CRP、PCT、Lac水平明显升高,PaO2/FiO2、BE明显下降;外周血CD80^+CD64^+、CD11b^+CD64^+、MPO^+、CD4^+和CD8^+T细胞数、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平明显降低,白细胞介素-10(IL-10)、内皮细胞生长因子(VEGF)水平明显升高;肺组织高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、晚期糖基化终末产物受体(RAGE)、促血管生成素2/1(Ang2/Ang1)的mRNA表达均明显升高,Toll样受体9(TLR9)、趋化因子(CXCL9、CXCL10)、TNF-α、IL-27、内皮细胞TEK酪氨酸激酶2(TIE2)、紧密连接蛋白血管内皮-钙黏蛋白(VE-CAD)和封闭蛋白(Occludin)的mRNA表达均明显下降;HE染色显示,肺泡腔炎性细胞浸润渗出、肺泡实变及肺泡间质层明显增厚、肺气肿。与LPS组比较,SF组Lac明显下降(mmol/L:4.2±1.0比6.3±1.1,P<0.05),BE、PaO2/FiO2明显升高〔BE(mmol/L):-6.4±2.6比-11.6±2.5,PaO2/FiO2(mmHg,1 mmHg=0.133 kPa):180±36比105±35,均P<0.05〕,CD80^+CD64^+、CD11b^+CD64^+、MPO+细胞比例均明显上升〔CD80^+CD64^+:(7.13±2.01)%比(3.80±0.46)%,CD11b^+CD64^+:(8.33±2.55)%比(2.15±0.47)%,MPO+:(21.22±2.33)%比(8.31±0.46)%,均P<0.05〕;肺组织HMGB1、RAGE的mRNA表达有一定程度下降〔HMGB1 mRNA(2^-ΔΔCT):1.81±0.45比2.23±0.85,RAGE mRNA(2^-ΔΔCT):6.69±3.48比11.60±6.91,均P<0.05〕,CXCL9和TIE2的mRNA表达有一定程度上升〔CXCL9 mRNA(2^-ΔΔCT):1.06±0.63比0.50±0.12,TIE2 mRNA(2^-ΔΔCT):1.42±0.68比0.27±0.16,均P<0.05〕;肺组织病理改变明显减轻。结论BE、Lac、PaO2/FiO2的加重,免疫耗竭、麻痹和无能,可能是导致严重脓毒症幼猪肺脏致死性损伤的重要因素,该损伤可能与HMGB1及其受体RAGE过度活化,TLR9和相应趋化因子及炎性因子受到抑制,导致血管内皮细胞损伤加重和紧密连接蛋白表达减少的毛细血管渗漏机制相关。参附注射液改善严重肺炎并脓毒症的免疫紊乱可能与上调外周血M1型巨噬细胞和激活中性粒细胞、抑制HMGB1及其受体RAGE表达、上调CXCL9和TIE2表达有关。

CCR2抑制剂延缓输尿管结扎小鼠肾纤维化

目的探究趋化因子受体2(CCR2)抑制剂(RS504393)在小鼠肾纤维化中的作用及其机制。方法将小鼠随机分为假手术组(sham组,单侧输尿管分离术)、UUO模型组(单侧输尿管结扎术)和给药组(UUO+RS504393,术前3天开始灌胃给予RS504393 25 mg/kg,早晚各1次,连续17 d);用Masson染色和HE染色观察肾脏纤维化程度和炎性细胞变化;流式细胞计量术分析各组小鼠肾脏CCR2及CD11b^+Ly6C^+单核细胞的比例。结果 UUO模型组肾间质炎性细胞数量较假手术组明显增多(P<0.05),给药组炎性细胞数量较模型组显著减少(P<0.05);UUO模型组肾脏胶原蛋白沉积面积较假手术组显著增加(P<0.05),给药组胶原沉积面积较模型组明显减少(P<0.05);UUO模型组肾脏CCR2比例较假手术组显著增多(P<0.05),给药组CCR2比例较模型组减少(P<0.05);UUO模型组肾间质CD11b^+Ly6C^+单核细胞群比例较假手术组明显增加(P<0.05),给药组CD11b^+Ly6C^+单核细胞群比例较模型组明显减少(P<0.05)。结论 CCR2抑制剂RS504393可减少CD11b^+Ly6C^+单核细胞浸润延缓肾脏纤维化。