HepG2细胞系CD133^+细胞对多柔比星的抗性及其机制

目的:探讨Hep G2中CD133^+细胞对多柔比星(doxorubicin,DOX)的抗性及其作用机制。方法:通过磁珠分选实验对Hep G2细胞中CD133^+细胞进行分选,流式细胞术检测CD133^+细胞阳性率,MTT法检测CD133^+细胞对DOX诱导凋亡的抗性,免疫荧光实验检测DOX处理各组细胞后P65激活转运情况,q RT-PCR检测各组细胞乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein,BCRP)m RNA表达水平;Western blotting检测CD133^+细胞凋亡相关蛋白的表达。结果:磁珠分选可以高效地富集Hep G2细胞中CD133^+细胞。与CD133-细胞相比,CD133^+细胞对DOX具有更强的抗性(P<0.05);与CD133-细胞、Hep G2细胞相比,CD133^+细胞中P65激活速度与表达水平明显提高(均P<0.05);CD133^+细胞中BCRP m RNA表达水平明显高于CD133-细胞和Hep G2细胞(均P<0.05);与Hep G2、CD133-组相比,CD133^+细胞组Bax和p53蛋白表达水平显著减少、Bcl-2和Survivin蛋白表达量显著增加(P<0.05或P<0.01)。结论:Hep G2细胞中CD133^+细胞亚群对DOX高耐药性的分子机制在于高表达存活相关蛋白NF-κB、Bcl-2、Survivin以及耐药性转运蛋白BCRP,而低表达促凋亡相关蛋白p53、Bax。

^(131)I-CD133mAb诱导CD133^+HepG2肝癌干细胞间质-上皮逆转分化

目的研究131I-CD133mA b可诱导CD133+Hep G2肝癌干细胞间质-上皮逆转分化(mesenchymal-epithelial transition,MET)及可能分子机制。方法 1用免疫磁珠分选法分选Hep G2人肝癌细胞,采用流式细胞术检测分选前后CD133的表达率,体外成球和体内成瘤实验鉴定其干细胞特性。2氯胺T法制备131I标记CD133mA b并用γ免疫计数器检测标记率、放化纯度。用不同剂量(0、2.4、4.8、9.6 MBq)的131I-CD133mA b作用CD133+Hep G2细胞,用Transwell侵袭实验检测侵袭能力,Western blot检测E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的蛋白表达水平。结果流式细胞术显示分选前后CD133表达率分别为(7.21±0.05)%和(95.26±0.05)%。CD133+细胞体外成球和体内成瘤能力强于CD133-细胞。γ免疫计数器检测131I-CD133抗体标记率为86.97%,放化纯度为98.84%。Transwell侵袭实验示131I-CD133mA b各处理组(2.4、4.8、9.6 MBq)24 h细胞穿过Matrigel胶的细胞分别为(107.7±3.2)、(76.3±2.5)、(44.0±3.0)/视野,显著少于对照组(0 MBq,P<0.01)。Western blot结果显示,与对照组(0 MBq)相比,131I-CD133mA b(2.4、4.8、9.6 MBq)处理组N-cadherin和Vimentin的蛋白表达量降低(P<0.01),E-cadherin的蛋白表达量增加(P<0.01)。结论在体外131I-CD133mA b作用于人肝癌CD133+Hep G2细胞可诱导间质-上皮逆转分化。

青蒿素抑制CD133+ HepG2细胞对γδT细胞的耐受性及其机制研究

目的探讨青蒿素是否能抑制CD133+肝癌细胞HepG2对γδT细胞的耐受性及研究其机制。方法 LDH释放实验检测γδT细胞及青蒿素共培养对CD133+及CD133-HepG2的杀伤活性;Western blot实验检测γδT细胞及青蒿素共培养对CD133+HepG2细胞MCL-1表达水平、Caspase-9、Caspase-3活化水平和细胞色素C释放水平的影响;流式细胞技术检测γδT细胞及青蒿素共培养对CD133+HepG2细胞凋亡和线粒体膜电位的影响。结果 LDH释放实验结果显示,在相同数量γδT细胞处理下,CD133+HepG2细胞LDH释放率显著低于CD133-HepG2细胞,表明CD133+HepG2细胞对γδT细胞治疗存在耐受性;同时,γδT细胞+青蒿素组CD133+HepG2的LDH释放率显著高于γδT细胞组和青蒿素+γδT细胞+MCL-1质粒组[(55.3±6.1)%比(18.7±2.6)%、(24.2±2.8)%,P<0.05]。流式细胞实验结果显示,γδT细胞+青蒿素组CD133+HepG2的凋亡率显著高于γδT细胞组和青蒿素+γδT细胞+MCL-1质粒组[(38.2±3.5)%比(10.5±1.1)%、(14.3±1.2)%,P<0.05]。Western blot实验结果显示,青蒿素处理能显著抑制CD133+HepG2细胞MCL-1蛋白表达水平。流式细胞实验结果显示,γδT细胞+青蒿素组CD133+HepG2相对线粒体膜电位显著高于γδT细胞组和青蒿素+γδT细胞+MCL-1质粒组[(0.21±0.02)比(0.78±0.05)、(0.71±0.05),P<0.05]。Western blot实验结果则显示,γδT细胞+青蒿素组CD133+HepG2的活化Caspase-9、Caspase-3及细胞色素C的释放均显著高于γδT细胞组和青蒿素+γδT细胞+MCL-1质粒组。结论青蒿素可能通过抑制CD133+肝癌细胞MCL-1表达水平抑制其对γδT细胞的耐受性。

β-catenin基因沉默对肝癌干细胞干性转录因子的影响

背景:肝癌干细胞是导致癌细胞形成、更新和增殖的原因,寻找针对肝癌干细胞治疗的关键靶点,并进一步拓展肝癌综合治疗手段是重要研究课题。目的:观察β-catenin基因沉默后CD133+HepG2细胞干性转录因子变化,探讨β-catenin调控肝癌干细胞干性的作用机制。方法:采用免疫磁珠筛选CD133+HepG2细胞,然后经干细胞培养基诱导、扩增方案获得CD133+HepG2肝癌干细胞,流式细胞术鉴定CD133+HepG2细胞阳性率,RNA干扰技术构建沉默β-catenin基因表达的β-catenin-shRNA慢病毒质粒,转染CD133+HepG2肝癌干细胞72 h,荧光标记并评估转染效率。确认β-catenin沉默后,平板克隆形成实验观察CD133+HepG2肝癌干细胞增殖情况,流式细胞术检测CD133+HepG2肝癌干细胞的细胞周期,qRT-PCR和Western blot检测干性转录因子SOX2,NANOG,OCT4的mRNA及蛋白表达水平。结果与结论:与空白对照组和病毒空载组相比,病毒干扰组的细胞克隆形成能力明显降低,G_(0)/G_(1)期细胞百分比明显增多,S期和G_(2)/M期细胞百分比降低,NANOG、SOX2、OCT4的蛋白和mRNA表达水平明显降低(P<0.05),提示下调β-catenin表达可能对抑制肝癌干细胞的干性水平具有潜在作用。