AAV介导的CD151基因促大鼠缺血后肢血管再生和血运重建的实验研究

目的研究肌肉转染腺相关病毒(AAV)介导的CD151基因在大鼠后肢缺血模型中促血管再生和血运重建的作用。方法分别包装携带有CD151基因和GFP基因的重组腺相关病毒(rAAV-CD151,rAAV-GFP)。将12只Wistar大鼠随机分为实验组和对照组,每组各6只。实验组大鼠左下肢肌肉注射局部转染rAAV-CD151,对照组注射rAAV-GFP(1×1010pfu/只)。基因转染2周后行股动脉切除术建立大鼠后肢缺血模型。通过后肢皮肤温度测定、后肢血管造影和缺血肌肉组织毛细血管密度检测,观察缺血肢体血管再生和评价血运重建情况。Western blot检测两组大鼠缺血肢体局部CD151的表达。结果股动脉切除术4周(基因转染6周)后,实验组大鼠缺血后肢平均皮肤温度为(32.92±0.63)℃,对照组为(31.22±0.87)℃;后肢血管造影结果显示实验组缺血侧血管评分平均为(2.56±0.37),对照组平均为(1.57±0.39);实验组缺血后肢肌肉组织毛细血管密度为(609.00±83.89)/mm2,对照组为(517.00±70.65)/mm2;两组比较差异均有显著性意义(均P<0.05)。Western blot检测结果显示实验组大鼠缺血侧肌肉组织CD151表达为对照组的2.96倍。结论局部高表达CD151基因能够提高缺血组织的血管再生能力,促进缺血器官的血运重建和功能恢复。CD151将为缺血性疾病的血管再生治疗提供新的靶点。

反义CD151基因转染对大鼠血管平滑肌细胞迁移的影响

目的观察pcDNA3.1真核表达载体介导的反义CD151基因转染对培养的大鼠动脉平滑肌细胞(VSMCs)迁移的影响。方法构建携带全长正义和反义CD151的真核表达载体pcDNA3.1-CD151和pcDNA3.1-anti-CD151重组质粒,转染体外培养的VSMCs,以RT-PCR和Western blot方法检测CD151的表达,用Boyden趋化小室方法观察细胞迁移。结果与载体对照组、脂质体对照组和空白对照组3组均值比较,转染48h后,反义CD151组mRNA表达降低58%,蛋白表达降低51%,正义CD151组的VSMCs CD151mRNA表达增加171%,蛋白表达增加133%;趋化迁移的细胞数,反义CD151组为37.9±6.3,正义CD151组为86.5±12.4;载体对照组、脂质体对照组和空白对照组分别为60.3±7.1、61.8±7.6和67.3±9.6。反义CD151组显著低于其余各组(P<0.01),正义CD151组显著高于其余各组(P<0.01)。结论pcDNA3.1真核表达载体介导的反义CD151转染,通过抑制CD151的表达,能够显著抑制大鼠VSMCs的迁移。

CD151基因对前列腺癌细胞增殖、转移的促进作用及其机制

目的研究人前列腺癌细胞株PC3细胞转染CD151基因后其增殖和迁移能力的变化及机制。方法用FuGENE HD分别将质粒pAAV-CD151(CD151组)、pAAV-GFP(GFP组)转染入PC3细胞,并设加入等体积PBS的对照组。48 h后采用Western blot检测CD151蛋白、磷酸化细胞外信号调节激酶(ERK)和总ERK的表达。采用MTT法检测CD151基因对PC3细胞增殖的影响,采用Boyden趋化小室研究CD151基因对PC3细胞迁移的影响。结果与对照组和GFP组相比,CD151组的CD151蛋白表达水平明显增加(均P<0.05);磷酸化ERK的表达量亦明显高于其它两组;细胞增殖能力比对照组和GFP组明显增高[相对吸光度值分别为:(0.245 7±0.006 4)vs(0.175 2±0.007 4)、(0.179 0±0.008 4)];细胞迁移数(107.8±9.6)亦显著高于对照组和GFP组[(53.0±7.6)和(57.0±5.2),P<0.05]。结论 CD151在前列腺癌细胞的增殖、转移中起着重要作用,是肿瘤转移的重要分子基础,其分子机制可能是CD151对ERK信号通路的激活。

RNA干扰CD151基因对子宫颈癌细胞增殖和迁移的影响

目的观察RNA干扰(RNAi)介导的CD151基因沉默对子宫颈癌细胞生长、迁移及侵袭的影响。方法采用免疫组化EnVision法检测子宫颈鳞状细胞癌及慢性子宫颈炎组织中CD151蛋白的表达;设计并筛选抑制CD151 mRNA表达的siRNA序列,构建含有shRNA序列的质粒转染子宫颈癌细胞;采用Western blot法筛选稳定沉默CD151基因的子宫颈癌细胞株,用于后续的细胞增殖、周期、凋亡、迁移和侵袭实验。结果CD151蛋白在子宫颈鳞状细胞癌组织中阳性;与空载体组及空白对照组相比,转染Psciencer2.0-shRNA-CD151重组质粒的子宫颈癌细胞CD151表达水平显著下降,细胞增殖活力明显降低,细胞周期被阻滞在G 1期,细胞凋亡显著增加,细胞迁移和侵袭能力亦受到明显抑制,差异有统计学意义(P均<0.05)。结论通过RNAi介导的CD151基因沉默可明显抑制子宫颈癌细胞的生长及恶性生物学行为,CD151有望成为治疗子宫颈癌的潜在靶点。

CD151基因转移对大鼠缺血后肢Rac1和Cdc42信号通路的影响

目的观察CD151在大鼠后肢缺血模型中的表达以及对Rac1和Cdc42信号通路的影响,进一步研究CD151促血管新生的分子机制。方法将实验大鼠随机分为4组,分别给予生理盐水,rAAV-GFP和rAAV-CD151分点注射至大鼠左后肢肌肉组织内,基因转染1 w后行股动脉切除术建立大鼠后肢缺血模型,假手术组不切除股动脉。6 w后用Western印迹方法检测各组大鼠缺血肢体局部CD151以及Rac1和Cdc42的表达。结果术后5 w,Western印迹检测CD151组的CD151蛋白表达水平明显高于其余各组(P<0.05),同时CD151组p-Rac1/Cdc42蛋白表达水平明显高于其余各组(P<0.05)。结论 CD151蛋白表达可以激活Rac1和Cdc42信号通路,促进缺血组织的血管新生。

反义CD151基因抑制血管损伤后内膜增生的实验研究

选择雄性SD大鼠57只,12只作为空白对照组(A组),其余45只随机分为反义CD151基因治疗组(B组)、载体对照组(C组)、生理盐水对照组(D组)。建立大鼠颈动脉球囊损伤模型,用血管腔内保留灌注和血管外膜渗透途径,将携带反义CD151基因的质粒转染入大鼠球囊损伤后的颈动脉中;取术后14d时的造模血管标本,以免疫组化法分析CD151蛋白表达;取28d时的造模血管标本,以HE染色观察形态学变化,测算管腔面积(LA)、内膜厚度(IT)、中膜厚度(MT)、内膜面积(IA)、中膜面积(MA)、IT/MT及IA/MA。结果免疫组化分析显示,B、C、D组血管CD151蛋白表达均较A组增强,B组明显弱于C、D组。HE染色病理切片显示,B组的LA、IT、MT、IA、MA、IT/MT及IA/MA均显著小于C、D组(P均<0.05)。提示反义CD151基因的局部转染可显著抑制大鼠颈动脉球囊损伤后血管内膜增生。

CD151基因干扰对人肺腺癌A549细胞侵袭与转移能力和裸鼠肺转移成瘤的影响

目的探讨CD151基因干扰对人肺腺癌A549细胞侵袭、转移能力及裸鼠肺转移成瘤的影响。方法将对数生长期人肺腺癌A549细胞随机分为3组:空白组、空载转染组和转染组,分别转染试剂、pGPU6/GFP/Neo-shNC和pGPU6/GFPNeo-CD151-450。将BALB/c-nu/nu雌性裸小鼠随机分为3组:空白组、空载转染组和转染组,每组10只。分别通过尾静脉注射细胞悬液100μL(约1×10^6个细胞)。用荧光定量聚合酶链反应法测定CD151基因表达,以细胞划痕实验检测A549细胞迁移能力,以Transwells小室检测A549细胞侵袭能力,以直接计数法观察裸鼠肺转移灶数量,以免疫组化SP法检测裸鼠转移瘤中CD151表达。结果空白组、空载转染组和转染组的细胞迁移率分别为(64.32±7.82)%,(64.86±6.31)%和(36.52±5.89)%;上述3组的穿膜细胞数分别为(88.4±3.5),(86.2±2.8)和(31.5±2.7)个。空载转染组和空白组比较,上述指标的差异均无统计学意义(均P>0.05);转染组与空载转染组比较,上述指标的差异均有统计学意义(均P<0.05)。空白组、空载转染组和转染组的裸鼠肺转移灶CD151表达率分别为(72.5±16.8)%,(68.6±13.2)%和(31.7±14.0)%。空载转染组和空白组比较,差异无统计学意义(P>0.05);转染组与空载转染组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论干扰CD151基因可抑制A549细胞系癌细胞的迁移和侵袭能力,CD151可能成为防治非小细胞肺癌的新靶点。

CD151基因导入脐静脉内皮细胞对细胞增殖的影响

目的:研究CD151基因导入脐静脉内皮细胞(HUVEC)对细胞增殖的影响,以进一步研究其生物学作用及其在血管生成中的作用机制。方法:通过构建p-AAV-CD151质粒并瞬时转染HUVEC,Western Blot检测CD151表达,采用MTT法测定HUVEC增殖的变化。结果:p-AAV-CD151组CD151表达明显增加,与正常对照组、p-AAV-GFP组比较表达差异有统计学意义(均P<0.05)。MTT法检测正常对照组、p-AAV-GFP组、p-AAV-CD151组的吸收度值分别为0.1663±0.0095、0.169±0.0085、0.2457±0.0044,p-AAV-CD151组较p-AAV-GFP组和正常对照组细胞增殖能力增强(P<0.05)。结论:CD151具有促进内皮细胞增殖的作用,CD151可能通过促进内皮细胞增殖达到促进血管新生的作用。

^13N—NH3 PET及冠状动脉造影评价CD151基因转染对小型猪心肌梗死后血流灌注的影响

目的用^13N—NH，PET及冠状动脉造影共同评价CD151基因转染促小型猪心肌梗死后血运重建。方法结扎20头小型猪冠状动脉左前降支（LAD），建立心肌梗死模型。对梗死区及梗死周围心肌直接注射CD151及绿色荧光蛋白（GFP）重组腺相关病毒（rAAV）进行基因转染。8周后用免疫组织化学方法分析心肌组织CD151蛋白的表达和心肌组织微血管密度，用^13N—NH，PET显像评价心肌血流灌注，用LAD造影评价侧枝循环的建立。采用SPSS11．0软件行配对t检验或方差分析（ANOVA）。结果CD151基因转染促进局部心肌组织CD151高表达并增加缺血区心肌组织微血管密度。rAAV—CD151组心肌血流灌注明显增加，心肌缺血总分值为10．82±2．36，明显小于rAAV—GFP组（19．33±1．67，t=5．86，P=0．002）。冠状动脉造影显示rAAV—CD151组缺血心肌的侧枝循环建立明显较rAAV—GFP组增加。结论CD151基因转染可以明显促进心肌梗死后血运重建、增加血流灌注。^13N—NH，PET及冠状动脉造影能直观地评价心肌血运重建。

CD151对人舌鳞癌细胞Tca8113迁移作用的影响

背景与目的:CD151在肿瘤组织中的高表达与肿瘤的转移和预后密切相关,但其具体机制尚不清楚。本研究旨在探讨携带全长正义和反义CD151基因的重组腺相关病毒(rAAV-CD151,rAAV-antiCD151)对人舌鳞癌细胞Tca8113细胞迁移的影响。方法:利用含酶切位点的PCR引物克隆CD151基因,分别呈正向和反向插入包装质粒pAAV,并包装成rAAV-CD151,rAAV-antiCD151,斑点杂交测定病毒滴度;rAAV-CD151与rAAV-antiCD151分别转染Tca8113细胞2周后,Westernblot检测CD151表达,通过Boyden趋化小室研究其对Tca8113细胞迁移的影响。结果:斑点杂交结果显示rAAV-CD151和rAAV-antiCD151病毒滴度分别为2.0×1011pfu/ml,1.0×1011pfu/ml;转染rAAV-CD151后,Tca8113细胞CD151的表达较未转染组增加了108%,细胞迁移数(93.6±11.6)显著高于未转染组和转染rAAV-GFP对照组(53.0±6.6和46.0±7.0,P<0.05);转染rAAV-antiCD151后,Tca8113细胞CD151的表达较未转染组减少了79%,细胞迁移数(24.0±4.4)显著低于未转染组和转染rAAV-GFP对照组(P<0.05)。结论:CD151在肿瘤细胞的迁移中起重要的作用,是肿瘤转移的重要分子基础。携带反义CD151基因的重组腺相关病毒作为一种新的治疗工具,可以特异性阻断肿瘤细胞CD151表达,抑制肿瘤细胞的迁移。

rAAV-CD151-AAA^194-196表达对大鼠缺血后肢血管新生的影响

目的观察CD151及其突变体在大鼠后肢缺血模型中的表达以及对血管新生的影响,进一步研究CD151促血管新生的分子机制。方法将实验大鼠随机分组,分别给予生理盐水,rAAV-GFP,rAAV-CD151和rAAV-CD151-AAA194-196(整合素α3/α6结合缺陷突变体),分点注射至大鼠左后肢肌肉组织内,基因转染1周后行股动脉切除术建立大鼠后肢缺血模型,假手术组不切除股动脉。建模5周后测定后肢皮肤温度,检测缺血肌肉组织毛细血管密度,Westernblot检测各组大鼠缺血肢体局部CD151的表达。结果术后5周,rAAV-CD151和rAAV-CD151-AAA194-196组的CD151蛋白及AAA194-196突变体蛋白表达水平明显高于其余各组(均P<0.05),rAAV-CD151和rAAV-CD151-AAA194-196两组间蛋白水平无明显差别,但rAAV-CD151-AAA194-196组大鼠缺血后肢平均皮肤温度和毛细血管密度明显低于rAAV-CD151组(均P<0.05)。结论研究证实CD151促血管新生是通过生成CD151-整合素α3/α6复合体而实现的,CD151-整合素α3/α6复合体的形成是CD151促血管新生的始动机制。

益肺逐积方联合环磷酰胺对Lewis肺癌小鼠肿瘤组织CD151、整合素α_3及β_1 mRNA表达水平的影响

目的研究益肺逐积方联合环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)对Lewis肺癌小鼠肿瘤组织CD151、整合素(integrin,ITG)α_3及ITGβ_1mRNA表达水平的影响。方法 C57BL/6小鼠右前肢腋窝皮下接种Lewis细胞建立肺癌小鼠模型,随机分为模型组、CTX组、益肺逐积方组、联合用药组,每组10只,造模次日益肺逐积方组和模型组分别给予益肺逐积方(14.95g/kg)和等体积生理盐水灌胃,1次/d;CTX组在造模后72h和10d腹腔注射CTX(40mg/kg);联合用药组在CTX组基础上灌胃益肺逐积方。给药期间观察小鼠状态及成瘤情况,给药14d后测量体重、瘤体积计算抑瘤率;常规石蜡切片检测肿瘤组织病理变化;荧光定量PCR检测肿瘤组织CD151、ITGα_3及ITGβ_1mRNA表达。结果与模型组比较,益肺逐积方组与联合用药组肿瘤体积减小(P<0.05);抑瘤率由高到低依次为:联合用药组、益肺逐积方组、CTX组。病理学检测结果显示肿瘤组织呈实片状排列并向骨骼肌浸润,肿瘤细胞沿细支气管壁及肺泡壁弥漫性生长。与模型组比较,益肺逐积方组、CTX组及联合用药组CD151mRNA表达降低(P<0.01,P<0.05),联合用药组ITGα_3mRNA表达量降低(P<0.05)。与CTX组比较,益肺逐积方组ITGβ_1mRNA的表达量降低(P<0.05)。结论益肺逐积方与CTX联合用药可更有效抑制Lewis肺癌小鼠肿瘤生长,益肺逐积方可通过下调肿瘤组织CD151和ITGα_3及ITGβ_1mRNA表达水平,达到治疗肺癌的功效。