高纯度CD3^-CD56^+CD16^+NK细胞体外扩增技术的研究

本研究探索高纯度CD3-CD56+CD16+NK细胞体外扩增技术。应用免疫磁珠分选法(MACS)分离出高纯度的CD3-CD56+CD16+NK细胞,置于含10%人AB血清的造血干细胞培养基(SCGM)中,加入细胞因子IL-2、IL-15、SCF组成不同培养体系进行体外扩增。采用细胞计数法、流式细胞术免疫表型分析和CCK-8试剂盒检测对K562细胞的杀伤率等方法比较不同培养体系对NK细胞增殖前后的数量、纯度及杀伤活性的影响;并采取相同方法对IL-2的浓度与NK细胞增殖效率及杀伤活性之间的关系进行探讨。结果发现,经免疫磁珠分选法所得的高纯度CD3-CD56+CD16+NK细胞扩增18天后,IL-2/IL-15/SCF组扩增倍数显著高于其他组(p<0.05);含细胞因子组的NK细胞对K562细胞的杀伤活性显著提高,尤其是IL-2/IL-15组和IL-2/IL-15/SCF组在效靶比10∶1时杀伤活性均高达90%以上。低、中、高浓度IL-2组扩增倍数之间比较差异无显著性(p>0.05),而在对K562细胞杀伤率的比较上,高浓度组明显高于低、中浓度组(p<0.05)。结论:在10%人AB血清的SCGM中加入IL-2/SCF/IL-15细胞因子组合,可使经MACS纯化的NK细胞在体外高效地活化及增殖;本培养体系中IL-2浓度较低(<1 000U/ml)时,NK细胞的扩增效率及对K562细胞的杀伤率与IL-2的浓度高低无相关性;而高浓度的IL-2(≥1 000U/ml)可进一步激活纯化后NK细胞的体外杀伤活性。

CD4^+、CD25^+、CD127 low调节T细胞及CD16^+、CD56NK细胞在脑梗死急性期患者外周血中的表达及其关系

目的探讨脑梗死(CI)患者外周血中CD4+、CD25+、CD127 low调节T细胞及CD16+、CD56NK细胞的百分比变化及两者在CI患者免疫反应中的相互作用机制。方法采用流式细胞术检测50例急性CI患者(发病2d)外周血中CD4+、CD25+、CD127 low调节T细胞及CD16+、CD56NK细胞的表达水平,并与健康对照组进行比较。结果急性CI患者(发病2d)外周血中的CD4+、CD25+、CD127 low调节T细胞的表达水平低于健康对照组,而CD16+、CD56NK细胞的数量则明显高于健康对照组(p<0.05)。结论急性CI患者发病2d,CD16+、CD56NK细胞表达水平上升,而CD4+、CD25+、CD127 low调节性T细胞表达明显低于健康对照组,说明CD4+、CD25+、CD127 low调节性T细胞和CD16+、CD56NK细胞是促进CI发生的原因之一。

2型糖尿病脾气虚证与CD16+CD56、CD25关系的初步探讨

目的 :探讨 2型糖尿病辨证分型的客观指标。方法 :用流式细胞技术测定 2型糖尿病脾气虚患者CD16+CD56、CD2 5的水平 ,并观察黄芪注射液治疗前后的变化。结果 :2型糖尿病脾气虚患者CD 16+CD56水平明显低于正常组 (P <0 .0 1) ,CD2 5水平明显高于正常组 (P <0 .0 1) ,黄芪注射液治疗前后虽有变化 ,但差异无统计学意义 (P >0 .0 5)。结论 :2型糖尿病脾气虚证患者存在着不同程度的CD16+CD56、CD2 5水平紊乱 ,且两者有一定的内在联系 ,但要作为特异性较强的客观指标 ,有待今后更深入的研究。

外周血淋巴细胞CD16＋CD56表达率对血小板减少性疾病鉴别诊断的价值

目的探讨外周血淋巴细胞CD16＋CD56表达率对不同血小板减少性疾病鉴别诊断的价值。方法应用流式细胞术检N28例正常对照者、47例特发性血小板减少性紫癜（ITP）患者、16例再生障碍性贫血（AA）患者、18例骨髓增生异常综合征（MDS）患者、13例急性淋巴细胞白血病（ALL）患者、37例急性非淋巴细胞白血病（ANLL）患者、11例慢性粒细胞白血病（CML）患者、6例慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者和12例自身免疫性溶血性贫血（AIHA）患者外周血淋巴细胞CD16＋CD56表达率。结果ITP组外周血淋巴细胞CD16＋CD56表达率低于正常对照组（P〈0．05）；AA组低于正常对照组（P〈0．05），高于MDS（P〈0．05）；白血病组较正常对照组明显降低（P〈0．05），ALL组、ANLL组、CML组、CLL组之间无明显差异，白血病患者外周血淋巴细胞CD16＋CD56表达率随病情发展、复发而降低，病情控制缓解而上升；AIHA组与正常对照组相比无明显差异。结论外周血淋巴细胞CD16＋CD56表达率的检测对鉴别血小板减少性疾病有重要意义，对患者的疗效及预后判断有一定的参考价值。

CD16+CD56+NK细胞在重症肌无力发病机制中的作用

目的:研究重症肌无力(MG)患者外周血CD16+CD56+ NK细胞的水平,及其在MG发病机制中的作用。方法:应用流式细胞仪检测16例MG患者与20名正常对照外周血CD16+CD56+NK细胞的百分率。结果:MG组外周血CD16+CD56+NK细胞百分率(13.81±5.59)%明显高于对照组的(7.23±1.95)%,P<0.05。结论:NK细胞在MG发病中起重要作用,既可通过分泌IFN2γ等细胞因子途径促进MG的发病,也可通过细胞毒作用发挥免疫效应。

CD3^-CD16^+CD56^+NK细胞水平变化在急性胰腺炎严重程度预测中的作用

目的分析急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)发病早期CD3^-CD16^+CD56^+NK细胞计数在AP严重程度预测中的作用。方法采用流式细胞仪荧光抗体标记法分别对164例AP患者的外周血单核细胞进行CD3、CD16、CD56荧光抗体标记,分析比较AP患者CD3^-CD16^+CD56^+NK细胞在外周血单核细胞中的百分比和计数情况,及其与AP严重程度的关系。用ROC曲线和AUC评价CD3^-CD16^+CD56^+NK细胞在外周血单核细胞中的百分比和计数对SAP的诊断价值。结果与正常对照组相比,MAP组、MSAP组和SAP组的CD3^-CD16^+CD56^+百分比和计数均显著下降,各组间差异有统计学意义(P<0.05)。CD3^-CD16^+CD56^+细胞百分比的AUC为0.86(95%CI:0.745~0.973),取值≤5.27%时,特异性为0.92,敏感性为0.79;CD3^-CD16^+CD56^+细胞计数的AUC为0.89(95%CI:0.808~0.961),取值≤0.056×109/L时特异性为0.90,敏感性为0.79。结论 CD3^-CD16^+CD56^+NK细胞在外周血单核细胞中的百分比和细胞计数对SAP早期诊断有一定的价值。

系统性红斑狼疮患者外周血CD3^-CD16^+CD56^+NK细胞水平变化的临床意义

分析系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血CD3^-CD16^+CD56^+NK细胞水平变化。94例SLE患者作为研究对象,另选取同期健康体检者50例为对照组。结果显示SLE组CD3^-CD16^+CD56^+NK细胞计数和百分率均明显低于对照组(P<0.05);Pearson积差分析显示CD3^-CD16^+CD56^+NK细胞计数与SLEDAI评分和24 h尿蛋白定量呈明显负相关性(P<0.05);以8.04%为临界值,CD3^-CD16^+CD56^+NK细胞计数判断SLE活动性的灵敏度为57.78%,特异度为78.57%,AUC为0.677。实验表明SLE患者外周血CD3^-CD16^+CD56^+NK细胞表达明显减少,观察其表达水平变化可为判断病情活动度和肾功能损害提供参考依据。

乙型肝炎病毒导致慢性乙型肝炎患者血中CD56^(dim)NK细胞亚群数量下降

目的观察乙型肝炎病毒对慢性乙型肝炎患者NK细胞亚群的影响。方法利用流式细胞术检测20例正常人及62例慢性乙型肝炎患者人外周血淋巴细胞CD3、CD4、CD8、CD56、CD16的表达;同时观察NK细胞亚群改变与乙型肝炎病毒携带量的相关性。结果①人类NK细胞根据CD56分子的表面密度可分为两个截然不同的群体,绝大多数(约90%)的NK细胞低水平表达CD56(CD56dim)且高表达CD16,少数NK细胞(10%)高水平表达CD56(CD56bright)且缺乏或低水平表达CD16;②慢性乙型肝炎患者CD56brightNK细胞的表达及绝对数量较正常对照组无明显的改变,CD3-CD56+、CD3-CD56dimNK细胞的绝对数量较正常对照组显著减少(P<0.05);③慢性乙型肝炎患者NK细胞亚群改变与患者的病毒携带量无关;④慢性乙型肝炎患者CD3+、CD3+CD4+比例及绝对数量较正常对照组显著减少(P<0.05)。结论机体感染乙型肝炎病毒后,导致CD56dim增殖的关键因子IL-2、IL-21活性下降,使CD56dim数量选择性减少,减弱NK细胞介导机体ADCC的功能。

反复种植失败患者黄体中期自然杀伤细胞的表达研究

目的比较反复种植失败(RIF)患者和经产妇黄体中期外周血和子宫内膜组织CD56^(+)自然杀伤(NK)细胞和CD16+NK细胞的差异,探讨RIF患者全身和局部免疫的特点。方法选取2018年1月至12月在广西壮族自治区妇幼保健院行体外受精(IVF)助孕的RIF患者作为RIF组(20例),经IVF助孕成功分娩1年以上的患者作为对照组(20例),取两组患者黄体中期的外周血和子宫内膜组织,使用流式细胞术测定两组外周血CD56^(+)NK细胞的比率,并使用免疫组织化学方法检测两组子宫内膜CD56^(+)NK细胞和CD16+NK细胞的表达。比较两组患者的外周血CD56^(+)NK细胞的比率和子宫内膜CD56^(+)NK细胞和CD16+NK细胞的表达。结果RIF患者黄体中期外周血CD56^(+)NK细胞比率高于正常组,子宫内膜CD56^(+)NK细胞比率低于正常组,CD16+NK细胞比率高于正常组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论外周血检测NK细胞比率可能反映子宫内膜局部的免疫状态。

流式细胞技术监测恶性肿瘤患者免疫机能的动态变化

目的 通过对数据的组内和组间比较分析,初步评估免疫细胞监测在恶性肿瘤患者辅助个性化诊疗和预后判断方面的临床可用性。方法 选取我院38例志愿者,建立恶性肿瘤患者(n=19)、健康人群(n=19)两个小组,分别在3个时间点取外周血,检测恶性肿瘤患者T细胞亚群、NK细胞水平以及IL-6、TNF-α含量的动态变化。结果 与健康人群相比,恶性肿瘤患者的细胞毒性T淋巴细胞(CD8^(+))极显著增高(P<0.01),而辅助性T淋巴细胞(CD4^(+))、CD4^(+)/CD8^(+)、免疫总淋巴细胞极显著降低(P<0.01),T淋巴细胞(CD3^(+))两组间差异无统计学意义(P>0.05);肿瘤人群的NK细胞(CD16^(+)和CD56^(+))活性显著增加(P<0.05)。炎症因子方面,肿瘤患者的IL-6极显著高于健康人群(P<0.01),而TNF-α差异无统计学意义(P>0.05)。此外,恶性肿瘤患者的免疫力呈现出明显的个体差异。结论 利用流式细胞技术监测免疫细胞水平,跟踪评估患者免疫机能的变化情况,可以帮助医生更清晰地了解患者的免疫状态,进而为其采取更个性化的诊疗手段提供科学依据。

人外周血NK细胞亚群、表型和生物学特征

目的:探讨人外周血NK细胞的异质性和生物学特征。方法:利用多种标记抗体进行细胞表面和细胞内细胞毒效应分子染色,再利用流式细胞仪在单个细胞水平上分析NK细胞亚群的多样性和生物学特征。结果:NK细胞可分为CD56+、CD56+CD16+和CD16+三个亚群。所有CD56+NK细胞均表达CD95,但表达水平的高(CD95bright)和低(CD95dim)不同。在CD95bright和CD8+细胞亚群中有43.5%的细胞同时表达颗粒酶B和穿孔素。而CD56+CD16+和CD16+细胞表达CD95均为CD95bright,同时表达颗粒酶B(83.6%)和穿孔素(89.8%)。结论:NK细胞乃异质性群体,随着CD56表达减少和CD16表达增加,其生物效应功能逐渐成熟。

NK细胞及淋巴细胞坏死率对URSA患者免疫治疗疗效的影响

目的探讨皮下注射淋巴细胞对不明原因性复发性流产(URSA)的临床疗效,回顾性分析免疫治疗前后CD16+CD56+NK细胞与淋巴细胞坏死率(CDC)的变化与妊娠结局的关系。方法应用荧光染色法和流式细胞术对行主动免疫治疗的440例URSA患者治疗前后淋巴细胞坏死率和CD16+CD56+NK细胞比率进行测定,并随访妊娠结局。结果353例成功妊娠至孕12周之后,成功妊娠率85.50%;60例在孕12周前再次流产,流产率为14.50%;其它(17例1年以上未孕,10例失访)。妊娠成功组治疗后淋巴细胞坏死率显著上升,CD16+CD56+NK细胞明显下降(P<0.01);失败组治疗后淋巴细胞坏死率升高,而CD16+CD56+NK细胞下降不明显(P>0.05)。结论主动免疫治疗效果较好,CD16+CD56+NK细胞和淋巴细胞坏死率是URSA患者孕前免疫状态的两个独立指标,亦是评价免疫治疗疗效的两个重要参数。

壹期煤工尘肺患者CD19^+B淋巴细胞、CD56^+CD16^+NK细胞表达及补体C3、C4水平

目的探讨CD19+B淋巴细胞、CD56+CD16+NK细胞和补体C3、C4水平在壹期煤工尘肺(CWP)中的变化及意义。方法采用流式细胞术检测56例壹期CWP患者(CWP组)、45例井下健康接尘矿工(接尘对照组)及48例井上健康人(正常对照组)外周血中CD19+B淋巴细胞、CD56+CD16+NK细胞表达水平;免疫比浊法检测血清补体C3、C4水平。结果与正常对照组和接尘对照组比较,CWP组CD19+升高,CD56+CD16+下降,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);C3与C4水平无明显改变(P>0.05)。接尘对照组CD56+CD16+和C4水平均高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05);CD19+和C3水平虽也有所升高,但差异无统计学意义(P>0.05)。CWP组C3与C4呈正相关(r=0.610,P<0.01),其他各指标间无相关性。结论壹期CWP患者存在B淋巴细胞介导的体液免疫上调,NK细胞免疫功能低下。

IVF-ET术后妊娠早期绒毛膜下血肿与NK细胞及其表面分子CD49d、CD11b的关系

目的:探讨辅助生殖(IVF^-ET)术后患者妊娠早期绒毛膜下血肿(SCH)与两种NK细胞亚型CD56^+CD16^+NK细胞、CD56^+16^-NK细胞及其表面整合素αm4(CD49d)、整合素αm (CD11b)的关系。方法:选取2019年2月^-2019年12月于本院生殖中心行IVF^-ET术助孕后临床妊娠患者41例,其中伴有绒毛膜下血肿20例为观察组,未合并绒毛膜下血肿21例为对照组。比较两组外周血中CD56^+CD16^+NK细胞、CD56^+16^-NK细胞及其表面整合素分子CD49d、CD11b的表达量。结果:CD56^+CD16^+NK细胞在观察组和对照组外周血淋巴细胞中的占比分别为9.73(6.32~15.18)%、9.96(6.50~12.68)%,CD56^+16^-NK细胞在观察组和对照组外周血淋巴细胞中占比分别为4.61(3.54~8.39)%、5.71(4.35~8.86)%,两组间均无差别(P>0.05)。CD11b在观察组和对照组CD56^+CD16^+NK细胞表面占比分别为98.59(97.20~99.33)%、100.00(99.80~100.00)%,CD11b在观察组和对照组CD56^+16^-NK细胞表面占比分别为78.09(60.64~86.24)%、87.09(80.36~91.33)%,观察组均低于对照组(均P<0.05)。CD49d在观察组和对照组CD56^+CD16^+NK细胞表面占比100.00(99.97~100.00)%、100.00(100.00~100.00)%,CD49d在观察组和对照组CD56^+16^-NK细胞表面占比99.52(97.93~100.00)%、99.44(98.28~100.00)%,观察组与对照组无差异(P>0.05)。结论:IVF^-ET术后妊娠早期合并绒毛膜下血肿患者外周血中CD56^+CD16^+NK细胞、CD56^+16^-NK细胞表面CD11b的表达低于IVF^-ET术后妊娠早期未合并绒毛膜下血肿患者,CD49d在两种细胞亚型表面的表达无差异。

原因不明复发性流产与CD56CD16NK细胞的相关性研究

目的:探讨原因不明复发性流产(URSA)与外周血和蜕膜组织中CD56+CD16-、CD56+CD16+NK细胞水平及CD56+CD16-/CD56+CD16+平衡的相关性。方法:选取30例早孕原因不明复发流产患者为试验组,20例正常早孕人流妇女为对照组,采集两组病例的蜕膜组织及外周血标本,分离淋巴细胞,用流式细胞技术检测各组标本中CD56+CD16-、CD56+CD16-NK细胞的数量,计算ED56+ED16-/CD56+ED16+平衡偏移。结果:两组外周血中CD56+CD16-细胞和CD56+CD16+NK细胞水平以及CD56+CD16-/CD56+CD16+比值差异均无统计学意义(P>0.05);两组蜕膜组织中,URSA组CD56+CD16+NK细胞水平升高,ED56+CD16-/ED56+CD16+比值降低,差异均有统计学意义(P<0.05),CD56+CD16-细胞与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);对照组蜕膜组织中CD56+CD16-NK细胞数及CD56+CD16-/CD56+CD16+比值均高于其外周血相应值,差异有统计学意义(P<0.05),CD56+CD16+NK细胞数在两组间差异无统计学意义(P>0.05);在URSA组中,蜕膜组织中的CD56+CD16-和CD56+CD16+NK细胞数均显著高于其外周血,差异均有统计学意义(P<0.05),CD56+CD16-/CD56+CD16+比值蜕膜组织中虽高于外周血,但无统计学意义(P>0.05)。结论:蜕膜组织中CD56+CD16+NK细胞水平升高以及由此引起的CD56+CD16-/CD56+CD16+比值的变化可能是原因不明复发性流产发生的一个主要因素。

泻肺化痰汤对肺炎咳嗽痰热闭肺证患儿NK细胞及其活性的影响

目的:探讨痰热闭肺证患儿经泻肺化痰汤治疗前后NK细胞亚群CD16+、CD16+CD56+及NK细胞活性的变化。方法:肺炎喘嗽痰热壅肺证患儿80例,随机分为2组,两组均采用西药常规治疗,治疗组40例采用泻肺化痰汤治疗。采用流式细胞术动态测定肺炎喘嗽第1天、第7天空腹外周血液NK细胞(CD16+,CD16+CD56+)亚群数目、采用乳酸脱氢酶法测定NK细胞活性,与同期40例对照组比较。结果:①肺炎喘嗽治疗组CD16+CD56+、CD16+NK细胞1 d分别为[(0.79±0.04)%]、[(0.34±0.06)%],7d分别为[(1.27±0.12)%]、[(0.55±0.05)%];急性期与恢复期比较,恢复期CD16+CD56+、CD16+NK细胞明显升高(P<0.01)。肺炎喘嗽对照组CD16+CD56+、CD16+NK细胞在1 d分别为[(0.80±0.05)%]、[(0.35±0.05)%],7 d分别为[(1.80±0.05)%]、[(0.78±0.04)%];在恢复期,对照组比治疗组明显升高(P<0.01)。②NK细胞活性两组1 d分别为[16.83±1.01]、[17.3±2.30],7 d分别为[31.53±1.58]、[24.08±1.29],两组NK细胞活性在恢复期均明显升高(P<0.01),治疗组较对照组升高更明显(P<0.01)。结论:泻肺化痰汤可以增强患儿NK细胞活性,提高其亚群CD16+、CD16+CD56+数目,提高患儿的免疫功能。

自身免疫性肝炎患者调节性T细胞及相关细胞因子与肝功能损伤的相关性研究

目的观察自身免疫性肝炎(AIH)患者不同时期外周血CD4+、CD2+5调节性T细胞亚群表达及细胞因子白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,探讨其与肝功能损伤的关系。方法选择AIH患者39例作为未治疗组,治疗后临床症状缓解23例,作为缓解组,20例健康体检者作为对照组。观察T细胞及相关细胞因子与肝功能损伤的关系。结果未治疗组外周血CD4+CD2+5T细胞比例显著低于对照组(P<0.05),NK细胞比例显著高于对照组(P<0.05)。细胞因子IL-2、TNF-α与对照组比较明显升高,未治疗组外周血CD4+CD2+5T的数量与肝功能损伤指标ALP、GGT呈负相关(r=-0.327,-0.318,P<0.05)。血清IL-2和TNF-α水平与肝功能损伤指标ALP和GGT呈正相关(r分别为0.524,0.521,0.412,0.413)。结论 T淋巴细胞免疫功能及细胞因子的紊乱在AIH发病机制中起一定作用。

HCG对反复种植失败患者种植窗期子宫内膜NK细胞亚型的影响

目的通过观察反复种植失败患者种植窗期HCG宫腔灌注后CD56＋CD16-和CD56＋CD16＋NK细胞百分比的变化,探讨HCG改变母胎界面的免疫微环境,介导免疫耐受的机制,进而为反复种植失败患者宫腔灌注HCG治疗提供理论依据。方法随机选择2013年1月～2015年1月在吉林省人民医院生殖中心行辅助助孕反复胚胎种植失败的患者共42例,实验组（宫腔灌注HCG组）21例：在自然周期/促排周期排卵后3 d或激素替代周期黄体酮注射后3 d用移植管宫腔灌注重组HCG 500 IU,3 d后取内膜组织,分离NK细胞。分别用流式细胞仪鉴定计数CD56＋CD16-NK细胞和CD56＋CD16＋NK细胞。对照组21例（单纯机械刺激组）：自然周期/促排周期排卵后3 d或激素替代周期黄体酮注射后3 d用移植管单纯行预移植,3 d后取内膜组织,分离NK细胞。分别用流式细胞计数CD56＋CD16-NK细胞和CD56＋CD16＋NK细胞。结果实验组CD56＋CD16-NK细胞百分比高于对照组,差异有统计学意义。结论宫腔灌注HCG能提高反复种植失败患者种植窗期子宫内膜局部CD56＋CD16-NK细胞百分比,诱导免疫耐受、进而提高子宫内膜容受性,促进胚胎植入。

化疗及胸腺肽α1对恶性肿瘤患者细胞免疫功能的影响及意义的临床研究

目的探讨化疗及胸腺肽α1对恶性肿瘤患者细胞免疫功能的影响及意义。方法 130例恶性肿瘤患者在化疗前一周及化疗2周期后分别检测外周血T细胞亚群(CD_3^+、CD_4^-、CD_8^+)B细胞(CD_(19)^+)NK细胞(CD_3^-/CD_(16)^-CD_(56)^+),并比较化疗前后的变化,随后随机分为A、B两组,在其他治疗相同的前提下,A组给予胸腺肽α11.6mg QodIH,2～6个月,B组不用胸腺肽α1治疗,2月后两组均行细胞免疫功能(CD_3^+、CD_4^+、CD_8^+、CD_(19)^+、CD_3/CD_(16)CD_(56)^+)测定。结果恶性肿瘤患者化疗后细胞免疫功能比较CD_3^+、CD_4^+细胞升高,CD_8^+细胞下降(P>0.05),CD_4^+/CD_8^+显著升高(P<0.05);A组与B组相比A组的CD_3^+、CD_4^+、CD_8^+、CD_4^-/CD_8^+、NK细胞活性较治疗前显著提高(P<0.05),B组各项指标治疗前后无显著差异(P>0.05)。结论化疗不会完全破坏机体的免疫功能,而会使部分免疫功能提高及调整;胸腺肽α1可以提高肿瘤患者的细胞免疫功能,从而增强抑瘤作用。