CD163基因敲除大白猪的抗蓝耳病性能和主要生产性能研究

[目的]运用CRISPR/Cas9基因编辑技术和体细胞核移植技术获得CD163基因全敲除(CD163 gene knockout,CD163-KO)的克隆猪,验证该基因敲除大白猪的抗蓝耳病特性,并研究其与野生型大白猪在生理、生产和繁殖性能等方面的差别,评估CD163-KO大白猪的主要生产性能。[方法]用猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)流行毒株NADC30-like对本研究所获得的11头CD163-KO大白猪和5头年龄、体质量相当的野生型大白猪进行攻毒试验。连续14 d观察猪的临床症状,记录直肠温度变化,检测血清中PRRSV病毒含量和抗体水平。14 d后取肺部组织进行切片,通过PRRSV免疫荧光试验观察肺脏感染情况。采集CD163-KO和野生型大白猪肺泡巨噬细胞进行免疫染色,观察肺泡巨噬细胞表面CD163蛋白的表达情况;采集猪外周血单核细胞进行诱导分化,观察CD163-KO与野生型大白猪诱导分化的巨噬细胞对血红蛋白-结合珠蛋白复合物的摄取情况。最后,统计分析CD163-KO与野生型大白猪的生产性能及公猪的繁殖性能。[结果]本研究获得的CD163-KO大白猪对蓝耳病NADC30-like毒株具有完全抗性,敲除CD163基因不影响巨噬细胞的生理功能,CD163-KO与野生型大白猪的生长性能和繁殖性能无明显差异。[结论]本研究是对CD163-KO猪抵抗蓝耳病的又一佐证和补充,证明CD163基因敲除操作对生产性能没有潜在的负面影响,为抗蓝耳病猪的生物安全提供了支撑。

猪CD163基因的单碱基编辑研究

旨在利用YE1-BE3-FNLS载体对猪的CD163基因进行C>T的单碱基突变,形成终止密码子TAA,从而导致CD163基因翻译的提前终止。利用网站在猪CD163基因的第7外显子筛选到高效率的sgRNA序列使其符合C5位点,并且C5后续的两个碱基为AA,CAA与起始密码子ATG之间的碱基数为3的整数倍。PCR扩增CD163-sgRNA和YE1-BE3-FNLS载体中的APOBEC-Cas9n-UGI片段,通过体外转录形成CD163-sgRNA和APOBEC-Cas9n-UGI mRNA。体外培养猪卵母细胞并进行孤雌激活,利用显微操作仪对孤雌胚胎进行CD163-sgRNA和APOBEC-Cas9n-UGI mRNA注射,待胚胎发育至桑椹胚和囊胚阶段,提取胚胎基因组DNA对单碱基编辑区域进行PCR扩增测序。结果显示,在49个候选sgRNA中成功筛选出一个CD163-sgRNA,利用PCR成功扩增了CD163-sgRNA和APOBEC-Cas9n-UGI片段,注射CD163-sgRNA和APOBEC-Cas9n-UGI mRNA后的猪孤雌胚胎发育到2~4细胞期。挑选注射的20个2~4细胞期胚胎经过PCR扩增与产物测序后发现有12个胚胎的CD163基因的第7外显子的预期位点C(num1479)>T,单碱基编辑效率约60%。对CD163-sgRNA的off-target分析发现,在错配3个碱基的情况下该CD163-sgRNA有5个off-target区域,对这5个区域进行PCR扩增和sanger测序分析后发现都没有发生C>T的突变。本研究利用YE1-BE3-FNLS工具在胚胎水平上对猪的CD163基因进行了单碱基编辑,成功使得该基因第7外显子预期位点(num1479)C变为T,从而使得密码子CAA变为TAA,可提前终止CD163基因的翻译。

利用双荧光素酶报告系统鉴定靶向作用猪CD163基因的miRNA

为了进一步筛选获得抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)增殖的候选mi RNA,为猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)防治及猪的抗病育种提供新策略,通过3′RACE(Rapid-amplification of c DNA ends)测序获得了猪CD163基因3′UTR的完整序列,生物信息学分析发现其具有mi R-181c、mi R-181d、mi R-23b、mi R-4262等mi RNA的作用靶点。利用双荧光素酶报告系统检测发现,与阴性对照组相比,mi R-181c、mi R-181d、mi R-23b和mi R-4262均可极显著(P<0.01)抑制荧光素酶的相对活性,其中mi R-181d抑制效果最佳。

PRRSV细胞受体CD163 SRCR5-SRCR6多克隆抗体的制备

【目的】制备鼠抗猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）细胞受体CD163 SRCR5-SRCR6多克隆抗体。【方法】提取PAM细胞总RNA，通过RT-PCR方法获得CD163 SRCR5-SRCR6（第1 417～2 136 bp，共720个bp）基因，将其克隆到pET-28a（＋）载体上，构建重组表达载体pET-28a（＋）-CD163，经酶切、PCR鉴定和测序验证后转化大肠杆菌，在BL21（DE3）中诱导重组目的蛋白表达，然后用Ni-NTA方法纯化目的蛋白，免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体，通过间接ELISA和IFA方法检测多克隆抗体效价，并初步鉴定多克隆抗体血清结合细胞及阻断PRRSV感染细胞的活性。【结果】克隆了720 bp的CD163 SRCR5-SRCR6基因，成功构建了pET-28a（＋）-CD163重组表达载体；SDS-PAGE结果表明，CD163 SRCR5-SRCR6重组蛋白被成功诱导并以包涵体形式表达；Western blot结果表明，重组蛋白具有良好的免疫原性，间接ELISA方法测得免疫Balb/c小鼠制备的抗CD163 SRCR5-SRCR6重组蛋白的多克隆抗体效价可达105；IFA试验结果显示，制备的抗CD163 SRCR5-SRCR6重组蛋白的多克隆抗体可与Marc-145细胞结合，且在1∶20、1∶40倍稀释时，能部分阻断高致病性PRRSV SD16毒株感染Marc145细胞。【结论】用大肠杆菌原核表达系统成功诱导表达了CD163 SRCR5-SRCR 6重组蛋白，用重组蛋白免疫小鼠获得了高效价多克隆抗体，其可以结合细胞并阻断PRRSV感染细胞。

猪繁殖与呼吸综合征病毒受体CD163基因敲除载体的构建

为构建猪繁殖与呼吸综合征病毒受体CD163基因缺失细胞系和进一步明确CD163在PRRSV感染过程中的作用,本研究以猪基因组为模板,扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒受体CD163基因同源左臂和同源右臂,并将扩增片段与pGEM-T载体连接后进行部分序列测定,同时与已知相应片段进行同源性分析,再将扩增的同源左右臂分别酶切后定向连接至pSSC-9载体中,成功构建了含Neo和Tk基因的双标记打靶载体pSSC-Larm-Sarm。

MicroRNA-136靶向CD163抑制CD68^+CD163^+M2型巨噬细胞极化的作用研究

目的:研究微小RNA(miR-136)通过靶向CD163抑制CD68^+M0巨噬细胞向CD68^+CD163^+M2巨噬细胞极化的作用机制。方法:采用流式细胞术检测20例肝细胞肝癌患者肿瘤组织及癌旁组织中CD68^+CD163^+M2巨噬细胞的比例,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测肿瘤及癌旁组织中miR-136的水平。分离人脾脏中CD68^+M0巨噬细胞,将细胞分为对照组(Control),miRNA模拟物组(miRNA mimic)和miRNA抑制物组(miRNA inhibitor)。IL-4和IL-13 10ng/m L诱导巨噬细胞M2型极化。采用流式细胞术检测CD68^+CD163^+M2巨噬细胞比例,Western blot检测细胞中CD163、TNF-α、诱导型一氧化氮合酶(i NOS)的表达以及M2巨噬细胞标志物精氨酸酶(Arg1)的表达,机制研究中检测JAK/STAT信号中蛋白酪氨酸激酶1(JAK1)、信号转导子与转录激活子1 (STAT1)和STAT6的水平,PI3K/AKT信号中磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)的表达。荧光素酶报告基因法确定miR-136与CD163的靶向关系。结果:肝癌组织中M2型巨噬细胞比例显著高于癌旁组织,而miR-136的表达显著低于癌旁组织,两者表达具有负相关。荧光素酶报告基因结果显示CD163是miR-136的靶基因。miRNA mimic组中CD68^+CD163^+M2巨噬细胞比例显著低于miRNA inhibitor组,与Control组比较无统计学差异。机制检测中发现miRNA mimic中JAK1、STAT6、PI3K、AKT1低表达,说明miR-136可以间接抑制JAK1-STAT6以及PI3K-AKT1的表达,抑制M2巨噬细胞极化。结论:miR-136可以靶向CD163抑制M2型巨噬细胞极化,其作用机制与JAK1-STAT6以及PI3K-AKT1抑制有关,这是M2巨噬细胞在肝癌免疫中的调节机制之一。

猪繁殖与呼吸综合征抗病育种研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS virus,PRRSV)引起的一种高度接触性传染病,严重危害我国乃至世界养猪业。然而由于PRRSV抗原的多变性,目前包括疫苗接种、药物治疗等在内的防治措施效果不佳。因此,随着现代分子生物学技术的不断发展,基于基因编辑技术对猪PRRS的抗病育种逐渐发展起来。本文简述了PRRS的临床症状,重点回顾了国内外PRRS抗病育种研究进展,通过分析PRRS的致病机制,重点阐述了PRRSV受体及针对不同受体进行编辑的体内及体外抗病毒效果,以期为未来深入研究PRRSV致病机制、开发PRRS抗病品种提供理论依据。

利用CRISPR/Cas9n技术生产抗蓝耳病的基因编辑克隆猪

本研究利用基于CRISPR/Cas9n系统的基因编辑技术结合体细胞核移植技术,构建了在同一载体中同时表达2条sg RNA和Cas9切刻酶以及绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的质粒,瞬时转染猪的成纤维细胞。通过流式细胞仪分选获得表达GFP的细胞,继续培养GFP阳性细胞至单个细胞长成细胞克隆点,经聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和DNA测序鉴定获得了对CD163基因进行编辑的细胞克隆点,阳性率高达90%(18/20)。以CD163基因编辑的细胞为供体细胞进行体细胞克隆和胚胎移植,获得了2头正常存活的CD163基因编辑猪。

结直肠癌中肿瘤相关巨噬细胞及基因表型的分析研究

目的结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)中肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)CD68^+及CD163^+的检测及与基因表型的关系。方法免疫组化方法检测41例CRC肿物,癌旁5 cm(M5)、10cm(M10)。不典型增生(Atypicalhyperplasia,AH)组织CD68^+及CD163^+的表达,采用病理切片扫描仪细胞计数。对41例CRC肿物进行基因检测。结果 CRC患者CD68^+及CD163^+检测肿物组织高于癌旁5cm、10cm(P<0.01);肿物与不典型组织比较差异无统计学意义(P>0.05);癌旁组织M5与M10比较差异无统计学意义(P>0.05);回归分析提示CD163^+表达与K-ras基因突变有显著性关系(P<0.05)。CD68^+及CD163^+的表达与B-raf基因突变、MSS(微卫星稳定型)、淋巴结转移、脉管癌栓、神经侵犯无相关性(P>0.05)。结论CD68^+及CD163^+在结直肠癌肿物间质中高表达,并高于癌旁组织,与AH表达无相关性。CD163^+在肿物的表达与K-ras基因突变有相关性。

血红蛋白清道夫受体CD163基因rs4883263位点多态性对冠状动脉粥样硬化性心脏病患者血脂水平的影响

目的:探讨血红蛋白清道夫受体(CD163)基因rs4883263位点多态性对血脂水平的影响,以了解该位点多态性对冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary heart disease, CHD)所起的可能作用,确定CD163基因rs 4883263位点与CHD的相关性。方法:选取2016年12月至2017年5月在青岛大学附属医院心血管内科诊疗的住院患者(其中男性116人,女性71人,人均63岁)外周血标本共187例,分为CHD组(n=97)和对照组(n=90),抽提外周血基因组DNA,采用实时定量荧光聚合酶链式反应(real time-polymerase chain reaction, RT-PCR)技术检测CD163基因rs 4883263位点多态性。利用统计学方法比较CHD患者和对照组的基因型分布的差异,分析该位点多态性对两组血脂各项指标的影响。结果:CHD组与对照组相比,三酰甘油(TG)和载脂蛋白A(apoA)显著升高,差异具有统计意义(P<0.05)。在CHD组和对照组共187名患者的CD163 rs 4883263基因型检测结果中可以看出,CD163 rs 4883263基因型以杂合型CC为主,等位基因以C为主要基因,2组人群中CD163 rs 4883263基因型及等位基因的频率比较差异均无统计学意义(均为P>0.05),进行性别分层后,2组人群中CD163 rs 4883263基因型及等位基因的频率分布比较差异仍无统计学意义(均为P>0.05)。CHD组CC基因型表达患者胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、apoA水平明显高于对照组,而CT基因型表达患者高密度脂蛋白(HDL)水平显著低于对照组(P<0.05)。结论:两组人群中CD163基因rs 4883263位点多态性明显影响血脂水平的高低。