人CD1d分子胞外区的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的:原核细胞表达人CD1d分子胞外区及制备其多克隆抗体。方法:用RT-PCR法扩增人CD1d分子胞外区基因,将其克隆入原核表达载体pET28中,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导重组蛋白的表达,用亲和层析法纯化重组蛋白,以之为免疫原免疫小鼠制备多克隆抗体,并以ELISA、Western blot及免疫组织化学法检测抗体。结果:在原核细胞中高效表达和纯化了人CD1d分子胞外区蛋白,用其免疫小鼠,获得了效价高、特异性较好的多克隆抗体,免疫组织化学检测显示该抗体可识别人小肠组织中的天然CD1d分子。结论:成功制备了人CD1d分子胞外区重组蛋白及鼠抗人CD1d分子胞外区抗体,为进一步建立人CD1d分子的免疫学检测方法及其生物学功能的深入研究奠定了基础。

慢病毒载体介导CD1d和GFP融合基因转染PANC-1细胞的实验研究

目的构建人免疫基因CD1d与绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)融合基因慢病毒载体并转染人胰腺癌细胞(PANC-1).方法实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增获得CD1d的全外显子片段,使之克隆到带GFP荧光报告基因慢病毒表达载体质粒中,慢病毒包装质粒和穿梭质粒转染293T细胞,包装成功后收集上清,浓缩,鉴定.通过慢病毒转染预实验确定MOI,进行人CD1d重组慢病毒载体转染胰腺癌PANC-1细胞株.结果电泳鉴定结果与目的基因表达条带完全吻合,克隆测序结果与NCBI收录的CD1d基因序列完全一致.重组慢病毒质粒可高效转染PANC-1细胞,荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光.结论成功构建了CD1d与GFP融合基因慢病毒表达载体并转染人胰腺癌细胞.

胃癌患者的CD1D基因甲基化异化及其临床意义

目的研究CD1D基因在胃癌组织及胃液中的甲基化异化情况,探讨其对胃癌诊断及患者预后评估的价值。方法选择2017年1月至2018年8月海南省肿瘤医院内镜中心诊治的77例胃癌及慢性胃炎患者。胃癌组37例,包含早期胃癌15例和进展期胃癌22例。胃炎患者40例,分为慢性非萎缩性胃炎组(20例)和慢性萎缩性胃炎组(20例)。所有研究对象在行胃镜检查时收集胃液并取病理组织标本[胃癌患者取胃癌组织及癌旁组织(距离肿瘤边缘>5 cm)]。通过甲基化特异性PCR(MSP)法检测各组的CD1D基因甲基化水平,并分析CD1D基因甲基化异化与胃癌患者临床病理特征的关系。结果胃癌组的胃癌组织中CD1D基因甲基化异化率为86.5%,与慢性非萎缩性胃炎组、慢性萎缩性胃炎组及癌旁组(25.0%、35.0%、56.8%)相比,差异均有统计学意义(P均<0.01)。胃癌患者胃液中CD1D基因甲基化异化率为54.1%,与慢性非萎缩性胃炎组及慢性萎缩性胃炎组(0、5.0%)相比,差异均有统计学意义(P均<0.01)。早期胃癌和进展期胃癌患者的胃癌组织中CD1D基因甲基化异化率分别为66.7%、100.0%,两者胃液中CD1D基因甲基化异化率分别为33.3%、68.2%,差异均有统计学意义(P均<0.05)。CD1D基因甲基化异化与胃癌患者的临床分期显著相关(P<0.05)。结论CD1D基因甲基化异化在胃癌早期即有发生,可作为潜在的胃癌分子诊断靶标及预后评估指标。胃液可用作CD1D基因甲基化异化检测标本。

CD1_D基因与B7-1基因共转染胰腺癌细胞及其抗癌作用的实验研究

目的观察共转染小鼠B7-1和CD1D基因对小鼠胰腺癌细胞的免疫应答。方法将表达B7-1和CD1D基因的逆转录病毒载体导入包装细胞系,然后转染入胰腺癌细胞。用PCR和Western方法鉴定细胞表达;用B7-1和CD1D阳性的细胞在体内诱导抗肿瘤免疫反应。结果B7-1和CD1D阳性的细胞在同基因小鼠体内能诱导抗肿瘤免疫反应并抑制肿瘤生长。结论B7-1基因和CD1D基因共转染肿瘤细胞,能抑制肿瘤生长,可能为肿瘤的基因治疗开辟一条新途径。

CD1d融合蛋白的表达及其在自然杀伤T细胞原代培养中的作用

目的构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(-)-CD1d-hIgG1-BriA tag,建立稳定表达CD1d融合蛋白的细胞系,并检测该蛋白对体外培养人原代自然杀伤T(natural killing T,NKT)细胞的活化刺激功能,为肿瘤过继性免疫治疗提供新方法。方法从健康人外周血提取CD1d全长基因作为目的 DNA片段,与真核表达载体pcDNA3.1(-)分别经双酶切后,酶切产物用T4 DNA连接酶连接,获得重组表达载体,经转染293T细胞、抗性筛选、质粒提取等步骤获得融合的重组质粒。将双酶切鉴定正确的质粒采用磷酸钙转染法导入CHO-K1细胞,经Western blot和ELISA法检测CD1d蛋白的表达,连续培养获得稳定表达CD1d的细胞系,经扩增培养收获培养液后,进行Protien A柱纯化。将纯化的CD1d蛋白用于人外周血经体外分离获得的单个核细胞的连续培养后,进行流式细胞术检测。结果质粒pcDNA3.1(-)-CD1d-hIgG1-BriA tag经双酶切鉴定构建正确。获得1株稳定表达CD1d蛋白的细胞株。纯化后的CD1d蛋白相对分子质量约196 000,能够激活单个核细胞中NKT细胞的扩增,培养第8天,CD3+CD56+NKT细胞显著增加,由培养前的0.30%扩增至4.99%。结论成功构建了pcDNA3.1(-)-CD1d-hIgG1-BriA tag真核表达质粒,建立了高效稳定表达CD1d蛋白的CHO-K1细胞株,为深入研究CD1d蛋白刺激活化NKT细胞奠定了实验基础,进一步证实了CD1d分子体外刺激NKT活化的功能,为最终免疫治疗提供了细胞。