CD2基因对卵巢癌肿瘤微环境中免疫浸润的作用

目的:探讨CD2基因对卵巢癌肿瘤微环境中免疫浸润的作用。方法:利用GEPIA在线工具检索CD2基因在卵巢癌中的表达情况,使用GEPIA和Kaplan-Meier plotter数据库分析CD2基因评估卵巢癌预后的价值;通过Coexpedia构建CD2基因在卵巢癌中的共表达基因网络。按评分高低筛选出关键基因,并通过GEPIA及cBioportal进一步分析CD2基因与关键基因的相关性,推测相关基因在卵巢癌中的表达及对预后的评估价值。利用TIMER分析CD2与相关基因在卵巢癌中的表达及与肿瘤微环境中的6种免疫细胞的相互关系。结果:①在癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库中,CD2基因在卵巢癌组织中的表达高于正常卵巢组织(P<0.05)。②GEPIA及Kaplan-Meier plotter均提示CD2基因高表达的患者总生存期更长(P<0.05)。③CD2基因的共表达基因有CD3D、LCK、ITK、CCL5、CD48、GZMK、PTPRC、TRAF31P3、SH2D1A、GZMA、CD247、CD52、IL10RA、CD3E、IKZF1、CD53、CD6、CXCR6及CD3G。④按评分高低排序,筛选出排序前5的关键基因,分别为CD3D、LCK、ITK、CCL5及CD48。CD2与CD3D、LCK、ITK、CCL5和CD48的表达呈正相关(P<0.05)。⑤利用TIMER分析得出CD2基因与卵巢癌中B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞的浸润情况呈正相关(P<0.05)。通过构建COX回归模型提示,巨噬细胞、中性粒细胞浸润水平与患者预后呈正相关,CD4+T细胞浸润水平与患者预后呈负相关(P<0.05)。结论:CD2基因在卵巢癌组织中高表达,其可能通过影响肿瘤微环境中免疫细胞的浸润影响患者预后。

CD59-linker-CD2融合基因真核表达系统的构建

目的 CD59和CD2都是重要的淋巴细胞膜表面分子,参与T细胞信号转导。文中构建CD59和CD2融合基因真核表达系统,探讨CD59向T细胞传递信号的机制及CD59与CD2的相互作用。方法在CD59基因和CD2基因间加入一段柔性链接头(linker)基因序列,构建CD59-linker-CD2融合基因真核表达系统。利用RT-PCR法从人T细胞白血病细胞系Jurkat细胞总RNA中扩增CD59和CD2基因,分别构建CD59-T和CD2-T重组克隆载体,经限制性核酸内切酶酶切后与pIRES质粒进行重组,构建pIRES-CD59-linker-CD2融合基因真核表达系统。结果测序证实CD59和CD2基因扩增成功;经限制性核酸内切酶酶切、PCR和测序鉴定表明携带CD59-linker-CD2融合基因的重组质粒构建成功。结论构建CD59-linker-CD2真核表达系统为在真核细胞中表达CD59与CD2并进一步探讨其在T细胞信号转导中的作用提供了实验材料。

中国汉族儿童散发性激素耐药型肾病综合征CD2AP基因突变分析

目的分析中国汉族散发性激素耐药型肾病综合征(SRNS)患儿CD2AP基因突变及其特点。方法40例中国汉族散发性SRNS患儿,以及50例尿检正常的汉族成年人,取外周静脉血3 ml,提取基因组DNA,应用聚合酶链反应(PCR)方法扩增CD2AP基因全部18个外显子及其周围的部分内含子,进行直接DNA序列测定。应用神经网络程序对CD2AP基因内含子突变进行隐蔽性剪接位点预测。结果在40例散发性SRNS患儿中检测出11种CD2AP基因多态性,并在3例散发性SRNS患儿中检测出3种在正常对照人群中未发现的CD2AP基因变异,IVS7-135G>A、1083T>C和IVS13-137G>A。神经网络程序分析结果结合临床表型提示,IVS7-135G>A突变为非致病突变、1083T>C和IVS13-137G>A突变的致病性不明确。结论中国汉族散发性SRNS患儿存在CD2AP基因突变,今后尚需对CD2AP基因突变与SRNS患儿临床表型的关联性进行详尽研究。

北京油鸡和海兰褐壳蛋鸡种公鸡精液品质比较及C2CD2和RYR2基因的差异表达分析

[目的]比较北京油鸡和海兰褐壳蛋鸡种公鸡的精液品质和性腺发育情况,并分析2品种间C2CD2和RYR2基因的表达差异。[方法]试验选取33周龄北京油鸡和海兰褐壳蛋鸡种公鸡各32只,从35周龄开始进行为期10周的精液品质检测。从2品种的每个重复中随机挑选1只种公鸡进行屠宰,记录其活体重、左右睾丸重以及鸡冠重并分析睾丸指数等,应用荧光定量PCR方法检测C2CD2和RYR2基因在2品种睾丸组织中的表达水平。[结果]海兰褐壳蛋鸡种公鸡的精子密度、精子总数和性腺发育情况均优于北京油鸡。C2CD2基因在北京油鸡中的表达量高于海兰褐壳蛋鸡,而RYR2基因在北京油鸡中的表达量显著低于海兰褐壳蛋鸡(P<0.05)。[结论]海兰褐壳蛋鸡的精子密度、精子总数和性腺发育情况均优于北京油鸡,RYR2基因可作为提高鸡精子总数的候选基因。

CD2AP基因多态性与晚发性阿尔茨海默病相关性研究

目的分析宁夏汉族人群CD2AP的rs9296559位点多态性与晚发性阿尔茨海默病（LOAD）是否存在关联。方法采用病例-对照研究,提取研究对象的外周血DNA,用ARRAY i PLEX行CD2AP基因的rs9296559位点单核苷酸多态性（SNP）的表达分布情况。结果 LOAD组和对照组的C等位基因频率分布比较差异有统计学意义（P〈0.001,OR=1.52,95%CI：1.18-1.97）。结论 CD2AP基因与宁夏汉族人群LOAD有相关性,其rs9296559 SNP位点C等位基因为危险等位基因。

cd99l2基因调控斑马鱼白细胞组织间的迁移机制

白细胞在个体发育、组织再生、先天及适应性免疫过程中都发挥了重要作用,而白细胞迁移至感染或创伤区域是其发挥免疫应答功能的必要条件。CD99L2作为黏附分子在白细胞外渗过程中发挥了重要作用,但其是否参与白细胞组织间的迁移尚不明确。本研究通过TALEN技术敲除斑马鱼(Daniorerio)cd99l2基因,发现cd99l2基因缺失后并不影响斑马鱼正常发育。尾鳍损伤后,cd99l2基因突变体在创伤组织处募集的中性粒细胞与巨噬细胞数目显著减少,进一步研究发现mfap4在cd99l2基因突变体中表达显著降低,这可能是影响巨噬细胞向损伤组织处迁移的原因之一。通过标记血管内皮细胞与中性粒细胞及巨噬细胞的转基因斑马鱼品系,发现受精后60h野生型或突变体斑马鱼中性粒细胞和巨噬细胞通过组织间迁移至创伤组织处,表明cd99l2基因参与了白细胞在组织间的迁移。利用RNA-seq分析发现,cd99l2基因突变体中RNA转录、蛋白质折叠及p450通路等被富集。黏附分子调控转录过程及信号传递在以往研究中已被多次证实。据此,本研究推测Cd99l2作为黏附分子参与了白细胞迁移过程中的级联信号通路。综上所述,本研究通过对斑马鱼的研究,发现了cd99l2基因在白细胞迁移过程中新的作用,有望对炎症免疫异常相关疾病提供理论基础。

尼罗罗非鱼CD2-like基因克隆及其胞外区表达研究

依据数据库中预测的尼罗罗非鱼白细胞分化抗原2(CD2)基因(GenBank登录号:XM_005460661.4)序列,采用PCR扩增体质量(150±50)g尼罗罗非鱼CD2分子同源类似物(CD2-like)基因编码区片段,然后以其胞外区构建原核表达质粒pGEX-6P1-CD2L,并进行原核表达及条件优化,最后进行复性纯化,为进一步研究该CD2-like分子在罗非鱼中的免疫功能奠定基础。研究结果表明,罗非鱼CD2-like(OnCD2-like)基因(GenBank登录号:MN296489)编码区全长1110bp,其中胞外区长558 bp。构建OnCD2-like胞外区的原核表达质粒pGEX-6P1-CD2L,将该重组质粒导入大肠杆菌BL21后,成功表达OnCD2-like胞外段重组蛋白。原核表达结果显示,目的蛋白分子质量为20ku,主要以包涵体形式存在,而该包涵体蛋白复性纯化最佳条件为:37℃下,0.2mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导6h,经梯度稀释复性并纯化后可成功获得目的重组蛋白。

CD59-CD2对T细胞信号转导的作用

目的将构建的CD59-linker-CD2融合基因真核表达载体在Jurkat细胞中稳定表达,研究CD59与CD2分子在T细胞信号转导中的相互作用,探讨CD59向T细胞内传递信号的相关机制。方法酶切鉴定构建的pIRES-CD59-linker-CD2融合基因真核表达载体,脂质体法转染Jurkat细胞,G418筛选建立稳定转染细胞系,免疫酶法检测转染细胞表面CD59的表达,Western blot检测转染细胞中CD59蛋白的表达;用CD59单克隆抗体作用于各组Jurkat细胞,使用激光共聚焦显微镜检测细胞浆内的Ca2+,ELISA检测细胞上清中白介素2(IL-2)的变化,比较各组差异。结果经酶切鉴定证实携带CD59-linker-CD2融合基因的重组质粒扩增成功;免疫酶法和Western blot证实CD59在转染细胞中稳定表达,且转染组L-Jurkat细胞比正常组Ju-rkat细胞CD59表达量增加,二者比较其差别有统计学意义(P<0.05);与正常细胞相比,胞浆内Ca2+和IL-2在转染细胞中均高表达,两组细胞比较其差别有统计学意义(P<0.05)。结论 pIRES-CD59-linker-CD2融合基因真核表达载体可在Jurkat细胞中稳定表达,CD59mAb交联刺激后,CD59可通过CD2向细胞内传递信号,引起细胞内信号分子的一系列变化,为研究CD59与CD2在T细胞信号转导中的协同作用及进一步探讨CD59向T细胞内传递信号的机制奠定基础。

条件性敲除CD4^+T细胞的多巴胺D2受体对帕金森病模型小鼠的影响

目的:研究CD4+T细胞上的多巴胺D2受体(dopamine receptor D2, DRD2)对帕金森病(Parkinson′s disease,PD)模型小鼠的影响。方法:条件性敲除CD4+T细胞DRD2基因的雄性小鼠(CD4-Cre Drd2fl/fl)、C57BL/6小鼠通过腹腔注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methy-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP)制备PD模型,注射7 d后,用旷场实验法来测量小鼠运动的平均速度,再无菌取小鼠脾脏,制备单个核细胞悬液,用Trizol法提取细胞总RNA,然后用实时荧光定量聚合酶链式反应法检测小鼠脾脏单个核细胞中的促炎因子白细胞介素(interleukin, IL)-17、干扰素γ(interferonγ, IFN-γ)和抗炎因子IL-4、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)的表达。用流式细胞术来检测脾脏中CD4+T细胞占单个核细胞的百分比。结果:CD4-Cre Drd2fl/fl PD模型小鼠旷场运动速度较野生型PD模型小鼠减慢,脾脏中CD4+T细胞占单个核细胞的百分比较野生型PD模型小鼠降低,脾脏单个核细胞中IL-17、IFN-γ的mRNA表达均高于野生PD模型小鼠,IL-4、TGF-β1的mRNA表达没有明显变化。结论:条件性敲除CD4+T细胞DRD2基因加重了PD模型小鼠的病变及外周炎症的变化。

非洲猪瘟病毒CD2v基因实时荧光PCR检测方法的建立

为建立一种准确、特异、高效、快速的非洲猪瘟病毒(ASFV)实时荧光PCR检测方法,本研究根据ASFV CD2v基因序列,设计了TaqMan荧光PCR引物及探针,通过优化退火温度、引物及探针的比例,建立了ASFV的TaqMan实时荧光PCR检测方法。结果表明,本研究所建立的荧光PCR方法具有良好的特异性和敏感性,以重组质粒为标准品建立的TaqMan荧光PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系,相关系数为0.988,斜率为-3.025 4,最低检测限可达到10 copies/μL,且与伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等多种猪病病毒不存在交叉反应。该方法重复性良好,批内和批间变异系数均小于2%。综上,本研究建立的非洲猪瘟CD2v基因实时荧光定量PCR方法为ASFV的检测提供了一种新的敏感、特异的分子检测技术。

中国南方汉族人3个家族性激素耐药型肾病综合征家系CD2AP和NPHS1基因突变分析

目的分析中国南方汉族人家族性激素耐药型肾病综合征(SRNS)家系CD2AP和NPHS1基因突变及其特点。方法研究对象为A、B、C 3个南方汉族SRNS家系先证者及其父母,A、B 2个家系先证者的姐姐和50例尿检正常的南方汉族成年人。取所有研究对象外周静脉血,提取基因组DNA,PCR方法扩增CD2AP基因全部18个外显子和NPHS1基因全部29个外显子及其周围的部分内含子,对PCR产物直接进行DNA序列测定。结果在3个SRNS家系先证者未检测出CD2AP基因致病突变。在B家系的先证者检测出NPHS1基因2398C>T(R800C)杂合突变,先证者父亲亦携带此杂合突变,但先证者母亲及姐姐未发现该突变。在50例对照人群中未发现2398C>T突变。此外,在3个先证者及50例对照人群还检测出9种已报道的CD2AP基因多态性——IVS4-25G>A、IVS8-95G>A、IVS10+36C>A、IVS10-153A>T、IVS10-110A>G、IVS11+82T>C、1204C>T、IVS16+24G>A、IVS17-66T>C和4种已报道的NPHS1基因多态性——349G>A、IVS24+36C>T、3315G>A和IVS27+45C>T。结论在1个中国南方汉族SRNS家系先证者检测出NPHS1基因突变——2398C>T,证实中国南方汉族人家族性SRNS儿童存在NPHS1基因突变,提示对其需进行NPHS1基因突变分析。

广东地区原发性激素耐药型肾病综合征患儿NPHS2、CD2AP基因突变筛查

目的研究广东地区原发性激素耐药型肾病综合征（SRNS）患儿NPHS2和CD2AP基因变异情况，探讨NPHS2和CD2AP基因变异与SRNS发病的关系，为儿童SRNS的临床诊治提供理论依据。方法随机选取26例广东地区原发性SRNS患儿和20例健康儿童，对其NPHS2基因8个外显子和CD2AP基因18个外显子的PCR产物进行直接测序，所得结果与美国国立生物技术信息中心（NCBI）的基因数据库进行比对，检测基因变异情况。结果26例患儿中14例SRNS患儿和4例健康对照组儿童存在NPHS2单核苷酸多态性（288C〉T，954T〉C，1038A〉G），均为已报道的单核苷酸多态性，但2组之间的基因型和等位基因频率比较差异均无统计学意义（P均〉0．05）；所测SRNS患儿中仅有2例检测出CD2AP基因1个内含子区突变（1917＋20C〉G）。结论NPHS2基因变异可能并非中国广东地区SRNS患儿发病的主要机制；CD2AP基因内含子突变可能增加患儿对早发性SRNS和局灶节段性肾小球硬化的易感性，提示内含子可能参与SRNS的发病。

激素耐药型肾病综合征与CD24P基因

CD2AP基因位于染色体6p12．3，编码CD2相关蛋白（CD2AP）。CD2AP对于维持肾小球足细胞裂孔隔膜结构和功能的完整性具有重要作用。CD2AP基因突变所致激素耐药型肾病综合征（SRNS）呈常染色体隐性遗传或常染色体显性遗传。CD2AP基因纯合突变导致早发型SRNS。CD2AP基因杂合突变可以增加患。肾小球疾病的易患性。携带CD2AP基因纯合突变的SRNS患儿肾移植后不再复发肾病综合征。对CD2AP基因的研究有助于指导SRNS的治疗和判断预后。

基于非洲猪瘟病毒CD2v基因TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为用于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)CD2v基因功能研究及区分ASFV野毒株和CD2v基因缺失毒株,本研究根据ASFV中国流行株(MK333180.1)的CD2v基因序列设计了1对特异性引物和探针,经过条件优化建立了一种以ASFV CD2v基因为靶标的能够鉴别ASFV野毒株和CD2v基因缺失毒株的TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法在质粒标准品为1.6×101~1.6×10^(8)拷贝/μL时,线性关系良好,线性相关系数R^(2)为0.998;该方法可以特异性检测ASFV,不与猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪圆环病毒1型和猪圆环病毒2型发生交叉反应;最低检测限为16拷贝/μL,比常规PCR的敏感性高出3个数量级;组内和组间重复性试验的变异系数均小于2%;能够有效地区分ASFV野毒株和CD2v基因缺失毒株;该方法与本实验室建立的针对ASFV p72基因的荧光定量PCR方法在检测临床样品时无统计学差异且符合率高。本研究所建立的TaqMan荧光定量PCR方法为ASFV的快速检测提供了新靶标,同时也为ASFV CD2v基因功能的研究、野毒株与CD2v基因缺失毒株的鉴别提供了有力的技术支持。

儿童激素耐药型肾病综合征与CD2相关蛋白基因启动子突变的相关性

目的检测CD2相关蛋白(CD2AP)基因启动子在儿童激素耐药型肾病综合征(SRNS)中的突变情况,探讨其在肾病综合征发病机制中的作用。方法采集65例SRNS患儿(SRNS组)和110例健康对照儿童(健康对照组)外周血并抽提DNA,采用PCR和DNA直接测序法对CD2AP基因启动子进行突变筛查。组间等位基因和基因型的分布差异采用χ2检验。结果 1.SRNS组检出1例CD2AP基因启动子突变(碱基变化-473C/T),健康对照组未发现该突变;2.SRNS组检出2例CD2AP基因启动子突变(碱基变化-441C/G),但健康对照组也发现3例该突变,可能为新的多态性位点;3.SRNS组17例患儿发现多态性(rs1056343,碱基变化-191A/C),健康对照组发现50例该多态性,2组突变基因型频数存在明显差异。结论 1.中国人群儿童中有CD2AP基因启动子多态性存在,CD2AP基因启动子-191A/C多态性可能与SRNS患儿的发病风险相关;2.CD2AP基因启动子存在-473C/T和-441C/G突变。

CD99L2基因及其相关疾病

CD99L2(CD99 antigen-like 2)基因位于染色体Xq28,编码高度保守、广泛表达的糖基化跨膜蛋白。自2003年首次报道以来,CD99L2蛋白被认为是一种重要的黏附分子,在炎症反应、白细胞渗出、淋巴瘤中起重要作用。但是,近年越来越多研究发现该基因与孤独症谱系障碍、脑性瘫痪、癫痫等神经系统疾病密切相关,但具体机制仍不清楚,该基因功能至今未明确。该文就CD99L2基因的研究进展进行综述。

非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株三重荧光定量PCR鉴别检测方法的建立及应用

针对非洲猪瘟病毒B646L、MGF505-2R和CD2v基因分别设计了引物和探针,经过条件优化,建立了基于TaqMan探针技术的三重荧光定量PCR检测方法。结果显示,本研究建立的三重荧光定量PCR检测方法与猪场常见病毒的核酸不发生交叉反应,具有良好的特异性;敏感性分析显示,针对B646L、MGF505-2R和CD2v基因的最低检测下限分别为6.5,8.0和14.0 copies/μL;并且该方法在10~10copies/μL模板范围内具有良好的线性关系,组间变异系数为0.05%~2.68%,组内变异系数为0.10%~1.17%,稳定性良好。进一步针对临床核酸样品的检测显示,本方法和OIE推荐的检测方法具有良好的一致性。本研究成功建立了非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失株的荧光定量PCR鉴别检测方法,为临床非洲猪瘟病毒的监测诊断提供了良好的技术支撑。

非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗株的构建和免疫保护特性

以我国首例非洲猪瘟疫情中分离的流行毒株(SY18)为亲本株构建了多基因家族(MGF)基因和CD2v基因缺失的非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗候选株,针对基因缺失株的安全性和免疫保护效果进行了特性研究。结果显示,MGF和CD2v双基因缺失株(ASFV SY18ΔMGF/ΔCD2v)对猪安全,接种猪能够100%抵抗亲本强毒株SY18株的攻击,对照猪全部死亡;说明该毒株可作为非洲猪瘟疫苗候选株。