尼罗罗非鱼CD2-like基因克隆及其胞外区表达研究

依据数据库中预测的尼罗罗非鱼白细胞分化抗原2(CD2)基因(GenBank登录号:XM_005460661.4)序列,采用PCR扩增体质量(150±50)g尼罗罗非鱼CD2分子同源类似物(CD2-like)基因编码区片段,然后以其胞外区构建原核表达质粒pGEX-6P1-CD2L,并进行原核表达及条件优化,最后进行复性纯化,为进一步研究该CD2-like分子在罗非鱼中的免疫功能奠定基础。研究结果表明,罗非鱼CD2-like(OnCD2-like)基因(GenBank登录号:MN296489)编码区全长1110bp,其中胞外区长558 bp。构建OnCD2-like胞外区的原核表达质粒pGEX-6P1-CD2L,将该重组质粒导入大肠杆菌BL21后,成功表达OnCD2-like胞外段重组蛋白。原核表达结果显示,目的蛋白分子质量为20ku,主要以包涵体形式存在,而该包涵体蛋白复性纯化最佳条件为:37℃下,0.2mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导6h,经梯度稀释复性并纯化后可成功获得目的重组蛋白。

鸡SLMO2基因CDS区克隆、生物信息学及组织表达分析

为了探究类果蝇慢移基因的氨基酸序列特征,探索其在不同肤色鸡不同组织中mRNA表达变化规律,实验采集不同肤色鸡各组织,PCR克隆获得SLMO2完整CDS区,进行生物信息学分析及组织表达分析。实验得到SLMO2的CDS区序列全长560 bp,其中可编码氨基酸174个。生物信息学研究结果表明,鸡SLMO2蛋白并不具有信号肽和跨膜结构,蛋白主要结构以无规性卷曲的α-螺旋结构结合为主,且蛋白分布在线粒体内膜间隙。通过氨基酸序列对比发现,鸡与爪蟾的亲缘关系较近。qRT-PCR结果表明,SLMO2在背肤组织中相对表达量极显著高于其他组织,且该基因在丝羽乌骨鸡背肤组织中表达量极显著高于“豫粉1号”H系鸡。以上结果为进一步探究鸡SLMO2对黑色素沉积的调控机制提供了理论依据。

FANCD2在子宫内膜癌中的表达及其意义

目的:分析范可尼贫血相关基因D2(FANCD2)在子宫内膜癌(UCEC)的表达及其意义。方法:生物信息学分析FANCD2在UCEC中的表达、预后及与免疫细胞浸润的关系;逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测FANCD2在62例子宫内膜癌和28例正常子宫内膜组织中的表达,分析其表达与临床病理特征的关系;敲减(KD)技术构建低表达的FANCD2载体,与空白载体一同转染Ishikawa细胞,检测不同浓度顺铂处理后Ishikawa细胞、Ishikawa-Vector、Ishikawa-FANCD2KD内谷胱甘肽(GSH)和脂质氧化(MDA)水平。结果:生物信息学分析显示,FANCD2在UCEC组织中高表达(P<0.05),且高表达的患者有较差的预后(P<0.05);免疫浸润分析显示,常见免疫细胞(B细胞、CD8^(+)T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞)的浸润与FANCD2负相关(P<0.05);与Ishikawa-Vector相比,经不同浓度顺铂处理后的Ishikawa-FANCD2KD中GSH水平降低(P<0.05);MDA水平增高(P<0.05)。结论:FANCD2在UCEC中高表达,FANCD2下调可能通过铁死亡增加Ishikawa细胞对顺铂的敏感性。

Bcl-2与CD34在基底细胞癌和毛发上皮瘤中的表达及意义

目的:探讨B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)和集落分化抗原34(CD34)在基底细胞癌和毛发上皮瘤中的表达及意义。方法:选取2008年1月—2023年9月常熟市第五人民医院收治的基底细胞癌和毛发上皮瘤143例,根据不同疾病类型将患者分成毛发上皮瘤组(n=85)和基底细胞癌组(n=58),对所有患者进行免疫组化检查,比较Bcl-2与CD34在不同疾病中的表达。结果:基底细胞癌组Bcl-2表达的阳性率为100.00%,CD34表达的阳性率为0.00%,毛发上皮瘤组Bcl-2表达的阳性率为89.41%,CD34表达的阳性率为13.48%,两组Bcl-2表达阳性率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。Bcl-2在基底细胞癌诊断中的敏感度高于CD34,特异度低于CD34,差异有统计学意义(P<0.05);两种检查方式在基底细胞癌诊断中的准确率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。Bcl-2在毛发上皮瘤诊断中的敏感度高于CD34,特异度低于CD34,差异有统计学意义(P<0.05);两种检查方式的准确率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:Bcl-2在基底细胞癌和毛发上皮瘤中呈高表达,在疾病的鉴别诊断中具有重要意义。CD34基底细胞癌中不表达,在毛发上皮瘤呈低表达,对于疾病的诊断和鉴别无显著意义。

CD2基因对卵巢癌肿瘤微环境中免疫浸润的作用

目的:探讨CD2基因对卵巢癌肿瘤微环境中免疫浸润的作用。方法:利用GEPIA在线工具检索CD2基因在卵巢癌中的表达情况,使用GEPIA和Kaplan-Meier plotter数据库分析CD2基因评估卵巢癌预后的价值;通过Coexpedia构建CD2基因在卵巢癌中的共表达基因网络。按评分高低筛选出关键基因,并通过GEPIA及cBioportal进一步分析CD2基因与关键基因的相关性,推测相关基因在卵巢癌中的表达及对预后的评估价值。利用TIMER分析CD2与相关基因在卵巢癌中的表达及与肿瘤微环境中的6种免疫细胞的相互关系。结果:①在癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库中,CD2基因在卵巢癌组织中的表达高于正常卵巢组织(P<0.05)。②GEPIA及Kaplan-Meier plotter均提示CD2基因高表达的患者总生存期更长(P<0.05)。③CD2基因的共表达基因有CD3D、LCK、ITK、CCL5、CD48、GZMK、PTPRC、TRAF31P3、SH2D1A、GZMA、CD247、CD52、IL10RA、CD3E、IKZF1、CD53、CD6、CXCR6及CD3G。④按评分高低排序,筛选出排序前5的关键基因,分别为CD3D、LCK、ITK、CCL5及CD48。CD2与CD3D、LCK、ITK、CCL5和CD48的表达呈正相关(P<0.05)。⑤利用TIMER分析得出CD2基因与卵巢癌中B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞的浸润情况呈正相关(P<0.05)。通过构建COX回归模型提示,巨噬细胞、中性粒细胞浸润水平与患者预后呈正相关,CD4+T细胞浸润水平与患者预后呈负相关(P<0.05)。结论:CD2基因在卵巢癌组织中高表达,其可能通过影响肿瘤微环境中免疫细胞的浸润影响患者预后。

ChREBP基因启动子甲基化调控TLRs/MyD88/NF-κB信号通路对2型糖尿病发病机制的研究

目的研究探讨碳水化合物反应原件结合蛋白(ChREBP)基因启动子的甲基化水平在2型糖尿病(T2DM)发病机制中的作用,同时验证CD14+类白细胞参与T2DM的发病机制。方法使用单纯随机抽样方法选取2019年1月至6月间内蒙古医科大学附属医院收治的T2DM患者40例(T2DM组),同时选取正常体检者20名(对照组)作为研究对象纳入分析。留取外周血测定CD14+单核细胞Toll样受体2(TLR2)、依赖髓样分化因子88(MyD88)、核因子κB(NF-κB)等相关因子表达水平,并比对正常人和T2DM患者全血DNA中ChREBP基因启动子的甲基化水平。结果T2DM组ChREBP甲基化水平均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。T2DM组TLR4、MyD88为1.23±0.32、1.86±0.36,均显著高于对照组(0.97±0.36、0.84±0.33),NF-κBP65、磷酸化IκB-ɑ为1.37±0.31、0.87±0.29,均显著低于对照组(1.95±0.31、1.50±0.37),差异均有统计学意义(P<0.05)。进一步分析可见,ChREBP甲基化水平与TLR4、MyD88呈正相关(r=0.334、0.387,P<0.05),与NF-κBP65和磷酸化IκB-ɑ呈负相关(r=-0.298、-0.326,P<0.05)。结论ChREBP基因启动子的甲基化水平增高与T2DM发病相关联,同时CD14+类白细胞参与T2DM的发生,提示ChREBP基因启动子甲基化可能通过调控TLRs/MyD88/NF-κB信号通路参与T2DM的发生过程。

中国汉族儿童散发性激素耐药型肾病综合征CD2AP基因突变分析

目的分析中国汉族散发性激素耐药型肾病综合征(SRNS)患儿CD2AP基因突变及其特点。方法40例中国汉族散发性SRNS患儿,以及50例尿检正常的汉族成年人,取外周静脉血3 ml,提取基因组DNA,应用聚合酶链反应(PCR)方法扩增CD2AP基因全部18个外显子及其周围的部分内含子,进行直接DNA序列测定。应用神经网络程序对CD2AP基因内含子突变进行隐蔽性剪接位点预测。结果在40例散发性SRNS患儿中检测出11种CD2AP基因多态性,并在3例散发性SRNS患儿中检测出3种在正常对照人群中未发现的CD2AP基因变异,IVS7-135G>A、1083T>C和IVS13-137G>A。神经网络程序分析结果结合临床表型提示,IVS7-135G>A突变为非致病突变、1083T>C和IVS13-137G>A突变的致病性不明确。结论中国汉族散发性SRNS患儿存在CD2AP基因突变,今后尚需对CD2AP基因突变与SRNS患儿临床表型的关联性进行详尽研究。

CD59-linker-CD2融合基因真核表达系统的构建

目的 CD59和CD2都是重要的淋巴细胞膜表面分子,参与T细胞信号转导。文中构建CD59和CD2融合基因真核表达系统,探讨CD59向T细胞传递信号的机制及CD59与CD2的相互作用。方法在CD59基因和CD2基因间加入一段柔性链接头(linker)基因序列,构建CD59-linker-CD2融合基因真核表达系统。利用RT-PCR法从人T细胞白血病细胞系Jurkat细胞总RNA中扩增CD59和CD2基因,分别构建CD59-T和CD2-T重组克隆载体,经限制性核酸内切酶酶切后与pIRES质粒进行重组,构建pIRES-CD59-linker-CD2融合基因真核表达系统。结果测序证实CD59和CD2基因扩增成功;经限制性核酸内切酶酶切、PCR和测序鉴定表明携带CD59-linker-CD2融合基因的重组质粒构建成功。结论构建CD59-linker-CD2真核表达系统为在真核细胞中表达CD59与CD2并进一步探讨其在T细胞信号转导中的作用提供了实验材料。

Cu^(2+)、Cd^(2+)胁迫对小麦幼根SOD活性及其基因表达的影响

采用水培试验探索不同浓度(0 mg/L、5 mg/L、30 mg/L和60 mg/L)Cu2+或Cd2+胁迫(24 h、48 h、72 h和96 h)后对小麦幼根超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响,并通过实时荧光定量聚合酶链式反应(real-timefluorescence quantitative PCR,Real-time Q-PCR)检测Cu/ZnSOD基因表达。结果表明,Cu2+胁迫处理72 h后,各处理SOD活性均较对照极显著提高(P<0.01),且30 mg/L浓度下SOD酶活性最高,是对照的3.67倍;而Cd2+胁迫处理后,幼根SOD活性整体呈现"升-降-升"的趋势,胁迫前期酶活性的降低程度与Cd2+浓度成正比,至72 h酶活性最低。Cd2+胁迫条件下Cu/ZnSOD的表达量明显高于Cu2+胁迫。不同时间Cu2+胁迫下,Cu/ZnSOD基因表达均呈现5 mg/L浓度处理高于60 mg/L和30 mg/L,表明低浓度促进而高浓度抑制该基因表达;而对于Cd2+胁迫,Cu/ZnSOD基因随浓度的升高和时间的延长呈现明显下降趋势,至96 h最低。本实验结果表明,Cu2+、Cd2+胁迫处理后浓度对基因表达的影响较大。该结果为深入探讨重金属胁迫下小麦幼根中SOD特性的研究提供理论参考和技术支持。

慢病毒介导的siRNA靶向CD47基因对人喉癌细胞Hep-2增殖、凋亡的影响

目的探究慢病毒载体介导siRNA抑制CD47基因表达后对人喉癌细胞株Hep-2体外增殖凋亡的影响。方法构建慢病毒载体,将靶向CD47基因的siRNA慢病毒转染至Hep-2细胞;用荧光显微镜行细胞形态学变化观察;RT-PCR检测细胞CD47 mRNA表达的变化;Western blotting检测CD47蛋白表达的变化情况;MTT法检测细胞的增殖凋亡情况。结果 CD47-siRNA慢病毒转染Hep-2细胞后,形态学观察显示CD47-siRNA能有效抑制Hep-2细胞增殖,细胞变形明显,体积变小,可见细胞坏死及凋亡。RT-PCR和Western blotting检测显示,CD47的mRNA和蛋白表达水平显著降低（P〈0.05）,使CD47 mRNA表达减少76%~82%,CD47蛋白表达减少77%;慢病毒转染细胞在48h后MTT检测细胞凋亡率明显提高（P〈0.01）。结论慢病毒介导的siRNA干扰CD47基因表达后,明显抑制了喉癌Hep-2细胞CD47的表达并且诱导了Hep-2凋亡。

胃癌组织CD_(44)v9和MMP-2基因的表达

目的:研究CD_(44)v9和MMP-2在胃癌和癌旁组织中的表达,探讨胃癌侵袭与转移的可能机制。方法:采用RT-PCR方法分别检测40例胃癌及癌旁组织CD_(44)v9及MMP-2的阳性表达情况。结果:40例胃癌组织中CD_(44)v9和MMP-2的阳性表达率分别为75％和82.5％,明显高于癌旁组织的35％和48.5％,二者比较差异均有显著性(x^2=12.929;x^2=10.769.P均≤0.001)。CD_(44)v9和MMP-2表达与肿瘤的大小、分化高低、浸润深度及临床分期有关,合并有淋巴结转移的17例胃癌患者CD_(44)v9和MMP-2表达率明显高于不伴有淋巴结转移的胃癌患者(P均<0.05),CD_(44)v9和MMP-2的表达与胃癌有相关性(r=0.6,P<0.001)。结论:CD_(44)v9和MMP-2与胃癌侵袭和转移性有关,可作为预测肿瘤转移潜能的指标。

海藻糖酶基因TRE2-like和TRE2在异色瓢虫羽化过程中的表达与功能

【目的】异色瓢虫Harmonia axyridis是一种重要的捕食性天敌昆虫,海藻糖在异色瓢虫的变态发育、羽化等整个生命过程都起着重要的作用。本研究以前期获得的类似膜结合型海藻糖酶(TRE2-like)与膜结合型海藻糖酶(TRE2)基因为基础,探讨在异色瓢虫羽化阶段这两个海藻糖酶的潜在功能,为阐明异色瓢虫从蛹发育到成虫时海藻糖代谢机制提供参考。【方法】根据TRE2-like和TRE2基因序列设计双链RNA(dsRNA)区域片段并合成对应的dsRNA,通过RNAi将其注射到异色瓢虫2日龄蛹中。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测RNAi处理后羽化第1天的异色瓢虫成虫糖代谢相关基因的表达;同时采用蒽酮比色法、酶标法等分别测定RNAi处理后羽化第1天的异色瓢虫成虫主要糖类物质含量及TRE活性变化,并观察异色瓢虫羽化后的表型变化。【结果】结果表明,与对照组(dsGFP注射组)相比,异色瓢虫2日龄蛹被注射TRE2-like或TRE2 dsRNA后,其新羽化成虫体内TRE2-like和TRE2表达量均极显著下调,且少数个体出现了蜕皮与翅形成困难等畸形表型。可溶性海藻糖酶活性在注射dsTRE2-like后显著降低,膜结合型海藻糖酶活性在注射dsTRE2后显著降低;注射dsTRE2后糖原含量显著下降,注射dsTRE2-like后糖原和海藻糖含量显著下降,注射dsTRE2-like+dsTRE2后糖原和葡萄糖含量显著下降,且海藻糖含量极显著下降。注射dsTRE2-like, dsTRE2和dsTRE2-like+dsTRE2后可溶性海藻糖酶基因TRE1-1和TRE1-2表达下降或显著下降,而TRE1-5表达上升或显著上升,海藻糖合成酶(trealose-6-phosphate synthase, TPS)、糖原磷酸化酶(glycogen phosphorylase, GP)、糖原合成酶(glycogen synthase, GS)基因的表达均显著下调。【结论】TRE2-like和TRE2基因表达被抑制后,异色瓢虫海藻糖等代谢受到影响。研究结果为探究异色瓢虫体内膜结合型海藻糖酶的潜在功能和调控机制奠定了基础。

大豆GmNAC73-like基因的克隆和表达及其对GmIFS2基因的影响

为研究NAC转录因子对大豆〔Glycine max(Linn.)Merr.〕异黄酮合成的影响,根据大豆基因组序列设计引物,从豆荚中克隆获得Gm NAC73-like基因,并对该基因序列进行生物信息学分析。结果显示:Gm NAC73-like基因包含1个长度981 bp的完整开放阅读框,编码326个氨基酸。Gm NAC73-like蛋白的理论相对分子质量37 000,理论等电点p I 6.4,为亲水性蛋白,无信号肽,并被定位在细胞核上,包含核定位信号"PKRRK"。同源性比对结果显示:Gm NAC73-like蛋白与野大豆(Glycine soja Sieb.et Zucc.)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula Gaertn.)、可可(Theobroma cacao Linn.)、葡萄(Vitis vinifera Linn.)及拟南芥〔Arabidopsis thaliana(Linn.)Heynh.〕的NAC蛋白具有较高的相似性,相似度分别为93%、69%、73%、75%和58%。在NJ系统树上,Gm NAC73-like蛋白与野大豆的Gs NAC8蛋白和木豆〔Cajanus cajan(Linn.)Millsp.〕的Cc NAC8蛋白聚在一起,显示出较近的亲缘关系。半定量RT-PCR分析结果显示:在大豆的三叶期、开花期和结荚期,Gm NAC73-like基因在根中均不表达,在茎和叶中可不同程度表达且茎中表达量较高;而在开花期或结荚期,该基因在花或豆荚中也可表达,且豆荚中表达量较高。酵母单杂交实验结果显示:Gm NAC73-like可与异黄酮生物合成关键酶基因Gm IFS2启动子中的CGTG基序结合;在大豆转基因发状根系中过表达Gm NAC73-like基因后,除查尔酮异构酶基因的表达量无变化外,其他异黄酮生物合成相关基因的表达量均不同程度提高,其中,肉桂酸-4-羟化酶基因和查尔酮合酶基因的表达量明显提高。此外,在Gm NAC73-like基因过表达的大豆转基因发状根系中总异黄酮含量显著降低。综合分析结果表明:Gm NAC73-like可能通过与MYB转录因子的互作调控Gm IFS2基因的表达,并在大豆异黄酮的生物合成过程中起负调控作用。

CD基因联合mIL-2/mGM-CSF基因治疗胃癌的研究

目的 :观察CD基因联合mIL 2 /mGM CSF基因对小鼠胃癌的治疗作用。方法 :CD基因构建于逆转录病毒载体pLxSN ,mIL 2和mGM CSF基因构建于pIRES。先用CD/ 5 FC治疗胃癌细胞株 ,然后联合mIL 2 /mGM CSF两种细胞因子基因治疗小鼠模型胃癌 ,以期产生显著的抗肿瘤作用。RT PCR检测基因表达。结果 :体外结果显示 2 0 %的转基因细胞即可杀灭70 %～ 80 %的肿瘤细胞。动物实验结果表明 ,应用CD/ 5 Fc ,即可产生很强的抗肿瘤作用。结合mIL 2 /mGM CSF两种细胞因子基因 ,抗肿瘤作用会得到进一步强化 ,肿瘤消退速度明显加快 ,大部分肿瘤完全消退。RT PCR结果显示 ,CD基因和mIL 2 ,mGM CSF基因均能在组织中表达。结论 :CD/ 5 Fc能够杀灭肿瘤细胞 ,具有显著抗肿瘤作用。联合IL 2 /GM CSF后 ,抗肿瘤作用会得到进一步强化 ,产生明显的抗肿瘤效应。应用病毒和脂质体方法转染自杀基因和细胞因子基因 。

红笛鲷(Lutjanus sanguineus)CD4和CD4-2基因克隆与诱导表达

应用RT-PCR和RACE-PCR技术克隆了红笛鲷(Lutjanus sanguineus)CD4和CD4-2基因,并分析了它们在健康鱼不同组织的表达分布及免疫刺激物诱导后的表达变化。CD4基因c DNA序列全长2216bp,包含180bp的5′UTR(untranslated regions)、605bp的3′UTR和1431bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码476个氨基酸;红笛鲷CD4-2基因c DNA序列全长为1520bp,包含62bp的5′UTR、525bp的3′UTR和933bp的ORF,编码310个氨基酸。CD4分子由信号肽、4个免疫球蛋白样结构域(D1—D4)构成的胞外区、跨膜区和胞浆区组成,CD4-2分子由信号肽、2个免疫球蛋白样结构域(D1—D2)构成的胞外区、跨膜区和胞浆区组成。荧光定量PCR(Real Time Quantitative PCR,q PCR)分析显示红笛鲷CD4和CD4-2基因在健康鱼的胸腺中表达量最高,其次是中肾、鳃、皮肤、脾、头肾和肠。红笛鲷头肾淋巴细胞体外经脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)和刀豆蛋白A(Concanavalin A,Con A)刺激12h后,CD4和CD4-2表达量显著上调(P<0.05)。哈维氏弧菌疫苗免疫24h后鳃、头肾、脾脏和肠的表达量显著上升(P<0.05)。研究结果为进一步研究鱼类CD4和CD4-2在抗菌免疫反应中的作用提供了基础资料。

CD15抗原和bcl-2基因蛋白在甲状腺癌中的表达及相关性研究

目的 研究甲状腺癌组织中CD15抗原和bcl 2基因蛋白的表达与肿瘤发生和转移的关系 ,并探讨CD15与bcl 2基因蛋白表达的关系。方法 应用微波 LSAB免疫组织化学法检测 5 0例甲状腺癌、45例甲状腺腺瘤和 2 0例癌旁正常甲状腺组织中CD15和bcl 2基因蛋白表达。结果 在甲状腺癌组织中CD15和bcl 2基因蛋白表达阳性率分别为 68.0 %和 46.0 % ,均显著高于甲状腺腺瘤和癌旁正常甲状腺组织 (P <0 .0 5 ) ;CD15和bcl 2表达阳性率均与甲状腺癌淋巴结转移相关 (P <0 .0 5 ) ,但与甲状腺癌组织类型无明显关系 (P >0 .0 5 )。CD15表达与bcl 2表达呈明显正相关性。结论 CD15和bcl

CD44和CYP2E1基因多态性与食管癌的相关性研究

背景与目的:食管癌是一种常见的恶性肿瘤,由于侵袭转移,手术后存活率低,而CD44和CYP2E1就是和侵袭转移相关的基因,因此我们研究了CD44和CYP2E1基因多态性与食管癌的关系。方法:应用PCR及Western blot技术等方法对45例食管癌患者癌组织及癌旁组织进行CD44表达分析和CYP2E1基因多态性分析。结果:癌组织中CD44蛋白呈高表达,明显高于癌旁组织,差异具有显著性(P<O.01)。CYP2E1三种基因型中,C1C1、C1C2基因型的表达明显高于C2C2,差异具有显著性(P<O.05)。结论:食管癌组织中CD44和CYP2E1多态性改变与食管癌的易感性关系较密切。

羊痘病毒P32基因与羊CD58基因共表达载体的构建

为了开发出一种可行的羊痘基因疫苗,尝试用羊P32基因与CD58基因建立共表达载体.试验根据GenBank中收录的羊痘病毒(GPV)P32和羊CD58基因组序列,设计了扩增GPV P32基因和CD58基因的特异性引物,运用PCR技术从GPV中扩增出P32基因,从羊的外周血中扩增出CD58基因,并将其分别克隆到pMD18-T载体,测序正确.将P32基因去掉后端疏水区一段与CD58基因先后克隆至载体pBudCE4.1,并转化大肠埃希菌JM109,提取质粒通过酶切鉴定和测序正确,且读码框正确.说明成功获得了真核共表达质粒pBudCE4.1/CD58/P32.

ATF-PAI2CD融合蛋白基因在毕赤酵母中克隆、表达和鉴定

为了克隆尿激酶型纤溶酶原激活物 (uPA)的氨基末端片段与纤溶酶原激活剂抑制物 2型(PAI 2 )突变体所构成的融合蛋白基因 ,并在Pichiapastoris中表达 ,应用PCR获得了人ATF PAI2CD融合蛋白基因cDNA(简称ATF PAI2CD) ,将其克隆到酵母表达载体pPIC9K ,获得融合基因表达质粒pZWY ATF PAI2CD .该质粒转化毕赤酵母菌GS115 ,用G4 18 YPD平板筛选高拷贝转化子 ,然后用甲醇诱导表达 .工程菌用摇瓶发酵 ,表达产物ATF PAI2CD占培养液中总蛋白 5 0 %以上 .经硫酸铵沉淀、分子筛和离子交换层析纯化得到的目标表达产物纯度达 95 % .Western印迹检测具有PAI 2与uPA的免疫原性 ,经牛奶板法检测具有纤溶抑制活性 .经流式细胞仪 (FCM )检测 ,能与肿瘤细胞特异性结合 .结果表明 ,ATF PAI2CD融合蛋白成功地在毕赤酵母中表达 ,且具有抑制uPA及与肿瘤细胞表面uPAR特异性结合的双重功能 .提示该融合蛋白可能具有良好的应用前景 .