人CD40-Ig融合蛋白表达载体的构建及其在COS-7细胞的表达

CD4 0 /CD4 0L途径是除B7/CD2 8途径之外的重要的共刺激信号转导途径 ,在T细胞活化过程中扮演着十分关键的角色。因而 ,该途径可能在同种移植排斥的诱导和效应阶段的不同时期发挥关键作用。本研究旨在获得人CD4 0分子胞外区和人IgG 1Fc段的融合蛋白 ,以探索阻断CD4 0 /CD4 0L共刺激途径在免疫治疗中的潜在应用。首先 ,从人B淋巴瘤细胞系Daudi中提取细胞总RNA ,利用RT PCR技术扩增人CD4 0分子胞外区基因 ,将扩增产物连接入pGEMTEasy载体中构建克隆载体 pGE4 0 ,利用全自动DNA测序仪进行序列测定。将测序正确的胞外区片段插入至含人IgG 1类抗体重链基因组序列的 pIG 1载体中构建瞬时表达载体 ,命名为 pIG/ 4 0Ig。用DEAE Dextran/Chloroquine法转染COS 7细胞 ,夹心ELISA法和Western印迹分析鉴定培养上清中CD4 0 Ig融合蛋白的表达及免疫学活性。在重组载体 pIG/ 4 0Ig转染COS 7细胞后 ,ELISA法检测到细胞培养上清中有融合蛋白的表达 ;Western印迹鉴定发现在相对分子量 5 0kD左右有一特异条带 ,该分子可同时被抗人CD4 0单抗G2 8 5和抗人Igγ链的单抗识别。本研究成功地扩增人CD4 0基因并构建了人CD4 0 Ig融合基因表达载体 ,在C0S 7细胞中获得功能性表达 ,为进一步研究CD4 0 /CD4

人CD40-Ig融合蛋白的纯化及其对人外周血CFU-T形成的影响

CD4 0 /CD4 0L相互作用在T细胞活化过程中扮演了十分重要的角色 ,参与了体内许多重要的生理和病理过程。本实验在建立了稳定表达CD4 0 Ig的CHO工程细胞株的基础上 ,对CHO工程细胞株的无血清大规模培养和融合蛋白的纯化进行了探索 ,并体外观察了纯化CD4 0 Ig对人CFU T的影响。结果表明 ,培养上清中融合蛋白产量约在 10 μg/ml以上 ,经ProteinG亲和凝胶纯化后蛋白纯度达 95 %以上。此外 ,该融合蛋白在体外可显著抑制人CFU T的形成 。

融合蛋白ICOSIg的三维结构模建的研究

目的:利用结构相似性的序列比对来模建ICOSIg的三维结构,分析其可能的结合位点,为 改造ICOSIg的突变体,提高其结合活性提供理论基础。方法:利用生物信息学手段分析ICOS所 属CD28家族各成员分子的结构域,通过基于结构相似的序列比对,以空间结构已经得到解析的 CTLA4为模板,利用同源模建的方法,模建ICOS膜外区的空间结构。进一步地以人IgG2和 CTLA4为模板,模建了ICOSIg全长的空间结构。在此基础上,结合氨基酸特性,分析其可能的功 能位点。结果:FDPPPF及KTKGSGN基序可能是ICOSIg的功能结合位点。结论:模建了ICOSIg 的空间结构,分析了其可能结合位点,为突变ICOSIg提高其亲和力提供了线索。

B7-CD28/CTLA4共刺激通路与胰岛移植

目的 探讨B7 CD2 8 细胞毒T淋巴细胞相关蛋白 4(CTLA4)共刺激通路在胰岛移植中的重要作用。方法 采用文献回顾的方法对该共刺激通路的分子结构、功能以及有关动物实验的资料进行综述。结果 B7 CD2 8 CTLA4共刺激通路是T淋巴细胞活化、增殖的信号传导通路之一 ,若缺乏共刺激信号 ,则会导致T淋巴细胞呈克隆无反应状态。CTLA4 Ig通过阻断CD2 8介导的共刺激通路 ,使胰岛移植物在受者体内长期存活。结论 通过对B7 CD2 8 CTLA4共刺激通路的研究 ,有助于了解移植胰岛存活的免疫机理。

人CD28-Fc融合蛋白在真核细胞中的表达与纯化

目的建立稳定表达CD28-Ig融合蛋白系统,提供用于研究的CD28-Ig融合蛋白。方法构建高表达的真核细胞表达载体,利用FAD批准的、可用于生产人用重组蛋白药物的CHO细胞进行表达,MTX加压筛选出稳定表达的细胞株。蛋白A纯化获得电泳纯融合蛋白。结果经RT-PCR,SDS-PAGE及Western印迹鉴定,CHO细胞上清中纯化的蛋白是CD28与Ⅰg的融合蛋白,并获得纯度较高的融合蛋白。结论成功建立CD28-Ig融合蛋白表达体系,并获得稳定表达融合蛋白的细胞株,为T细胞活化第二信号系统的基础研究奠定了基础。

人CD40-Ig融合蛋白在CHO细胞中的表达与纯化研究

目的 建立稳定表达CD40 Ig融合蛋白的工程细胞株 ,获得大量融合蛋白以研究靶向阻断CD40∶CD40L途径防治移植物抗宿主病 (GVHD)策略的应用潜力。方法 自真核瞬时表达载体pIG 40Ig中切下CD40 Fc融合基因 ,插入pcDNA3.1载体中构建稳定表达载体。利用脂质体Lipo fectamine将该载体转染CHO细胞 ,G418筛选抗性克隆 ;夹心ELISA法检测上清中CD40 Ig融合蛋白的表达 ;Westernblot法鉴定其免疫学活性。利用有限稀释法对筛选出的混合克隆单克隆化。滚瓶法无血清大批培养工程细胞 ,ProteinA亲和层析法纯化 ,SDS PAGE后薄层扫描分析纯度。利用流式细胞术检测该蛋白与Jurkat细胞表面CD40L的结合功能。结果 CD40 Fc融合基因插入pcDNA3.1载体后构建成功稳定表达载体p3.1 40Ig ,转染CHO细胞后经 2次克隆化获得稳定表达CD40 Ig融合蛋白的基因工程细胞株 ,命名为B2。ProteinA亲和层析纯化后融合蛋白纯度达 95 %以上 ,该融合蛋白可特异结合Jurkat细胞表面的CD40L。结论 CD40 Ig融合蛋白可模仿天然分子与其配基结合 ,为研究靶向CD40∶CD40L途径的治疗制剂在防治GVHD中的潜在应用提供了有用的工具。

阻断CD40/CD40L相互作用延长移植物抗宿主病小鼠存活时间

目的 :克隆表达人CD4 0 Ig融合蛋白 ,并在小鼠移植物抗宿主病 (GVHD)模型中研究利用其阻断CD4 0 CD4 0L相互作用的保护性效果。方法 :利用RT PCR技术自人Daudi细胞系中克隆CD4 0基因胞外区 ,并插入含有人IgG1Fc段基因的pIG1载体中 ,构建携带CD4 0 Fc融合基因的瞬时表达载体转染COS 7细胞 ,间接夹心ELISA法检测CD4 0 Ig融合蛋白的表达。再将CD4 Fc融合基因连接入pcDNA3.1的相应位点构建稳定表达载体转染CHO细胞 ,筛选分泌CD4 0 Ig融合蛋白的阳性重组CHO细胞并进行无血清大规模培养 ,收获培养上清利用ProteinA亲和层析法纯化融合蛋白。SDS PAGE、Westernblot和配基结合实验鉴定CD4 0 Ig的性质。将C5 7BL6 J(H 2 b)小鼠的脾细胞经尾静脉注射入亚致死剂量照射的BALB c(H 2 d)小鼠体内建立急性GVHD模型 ,通过体内注射CD4 0 Ig融合蛋白评价其对急性GVHD小鼠的保护效果。结果 :按上述方法分别构建了哺乳动物表达载体pIG 4 0Ig和p 3.1 4 0Ig。ELISA和Westernblot确定在COS 7和CHO细胞中表达了CD4 0 Ig融合蛋白。SDS PAGE结果显示该蛋白具有通过二硫键结合的二聚体结构并以同源二聚体的形式存在。纯化的CD4 0 Ig可与CD4 0L结合。体内应用CD4 0 Ig融合蛋白治疗可延缓小鼠GVHD病情发展并显著延长小鼠的?

人CD40-Ig融合蛋白对小鼠GVHD的保护作用研究(英文)

目的 在小鼠GVHD模型中研究利用人CD4 0 Ig阻断CD4 0 /CD4 0L相互作用的保护性效果。方法 将人CD4 0基因胞外区插入含有人IgG1Fc段基因的pIG1载体中 ,构建携带CD4 0 Fc融合基因的瞬时表达载体转染COS 7细胞 ,ELISA法检测CD4 0 Ig融合蛋白的表达。再将CD4 0 Fc融合基因连接入pcDNA3 1的相应位点构建稳定表达载体转染CHO细胞 ,利用ProteinA亲和层析法纯化融合蛋白。SDS PAGE、Westernblot和配基结合实验鉴定CD4 0 Ig的性质。将C5 7BL6 /J(H 2 b)小鼠的脾细胞经尾静脉注射入亚致死剂量照射的BALB/c(H 2 d)小鼠体内建立急性GVHD模型 ,通过体内注射CD4 0 Ig融合蛋白评价其对急性GVHD小鼠的保护效果。结果 按上述方法分别构建了哺乳动物表达载体pIG/ 4 0Ig和p3 1/ 4 0Ig。ELISA和Westernblot确定在COS 7和CHO细胞中表达了CD4 0 Ig融合蛋白。SDS PAGE结果显示该蛋白具有通过二硫键结合的二聚体结构并以同源二聚体的形式存在。纯化的CD4 0 Ig可与CD4 0L结合。体内应用CD4 0 Ig融合蛋白治疗可延缓小鼠GVHD病情发展并显著延长小鼠的平均存活时间。结论 我们的结果证明CD4 0 /CD4 0L相互作用在GVHD的病理过程中可能起到了十分重要的作用 ,提示人CD4 0 Ig融合蛋白在临床预防和治疗GVHD方面的巨大应用?

可诱导共刺激分子与人IgGFc融合蛋白诱导同种免疫低应答的体内外实验

目的探讨真核表达人可诱导共刺激分子（ICOS）与人IgGFc融合蛋白（ICOS-Ig融合蛋白）在体内外对同种免疫应答的影响。方法构建ICOS-Ig融合蛋白表达载体，在CHO细胞中表达并纯化ICOS-Ig融合蛋白。以Balb／c小鼠脾细胞为反应细胞，经CO^60照射灭活的C57BL／6小鼠脾细胞为刺激细胞，进行初次混合淋巴细胞反应（MLR），MLR体系中分别加入50μg／ml ICOS-Ig融合蛋白（ICOS-Ig组）或对照IgG（IgG组），采用氚标记胸腺嘧啶脱氧核苷（^3H-TdR）掺入法检测反应细胞的增殖情况，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测培养上清液中白细胞介素（IL）2、4、10以及γ干扰素（IFN-γ）的含量。收集初次MLR细胞，与灭活的C57BL／6小鼠脾细胞或C3H小鼠脾细胞共培养，进行再次MLR，检测指标同初次MLR。以Co^60照射Balb／c小鼠，经尾静脉输注用羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）标记的C578126小鼠脾细胞，每天腹腔注射ICOS-Ig融合蛋白0．2mg（ICOS-Ig组）、IgG（对照IgG组）或环孢素A（CsA组），3d后取Balb／c小鼠脾细胞，流式细胞仪测定CFSE荧光强度以判断同种T淋巴细胞的体内增殖情况。结果初次MLR显示，ICOS-Ig组同种T淋巴细胞活化增殖的抑制率为（58±8）％，其培养上清液中IFN-γ的水平明显高于IgG组（P〈0．05）。再次MLR显示，ICOS-Ig融合蛋白能特异性抑制C57BL／6小鼠脾细胞所致的细胞增殖，抑制率为（42±8）％，IL-4和IL-10的分泌受到抑制，而IFN-γ的分泌增加；ICOS-Ig融合蛋白并不抑制第三方细胞所致的细胞增殖。体内实验显示，ICOS-Ig组和CsA组的CFSE荧光强度明显强于空白对照组和对照IgG组（P〈0．05），而联合处理组CFSE荧光强度强于ICOS-Ig组和CsA组（P〈0．05）。结论ICOS-Ig融合蛋白在体内外均可抑制同种T淋巴细胞的活化增殖，且这种作用具有特异性。