非洲猪瘟病毒CD2v蛋白胞内域与胞外域的原核表达及其抗原性分析

【目的】应用大肠杆菌表达系统表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)CD2v蛋白胞外域(N-端,CD2v-N)与胞内域(C-端,CD2v-C)并分析两者的抗原性,为ASFV检测方法的研发提供试验依据和指导。【方法】构建CD2v-N和CD2v-C的重组原核表达质粒,在体外表达并纯化CD2v-N和CD2v-C蛋白,通过Western blotting对表达蛋白进行鉴定;用表达的CD2v-N和CD2v-C蛋白分别肌内接种免疫新西兰大白兔,共免疫3次,每次间隔2周;每次免疫后14 d,应用ELISA方法测定CD2v-N或CD2v-C的特异性抗体水平;用纯化后的CD2V-N和CD2v-C蛋白作为包被抗原,通过ELISA方法检测95份ASFV感染猪的血清CD2v-N或CD2v-C特异性抗体,比较CD2v-N和CD2v-C在猪体内诱导的免疫反应水平。【结果】重组蛋白CD2v-N和CD2v-C分别以包涵体和可溶性形式表达,分子质量分别为22.9和34.0 ku,均能与猪抗ASFV血清特异性结合;用CD2v-N蛋白首免家兔后14 d,血清中未检测到特异性抗体,而在CD2v-C首免的家兔血清中检测到了高滴度的特异性抗体;三免后14 d,CD2v-N和CD2v-C蛋白免疫家兔的血清特异性抗体效价分别为1∶125000和1∶107;ELISA检测结果显示,ASFV感染猪的血清中CD2v-C特异性抗体水平显著高于CD2v-N(P<0.05)。【结论】本研究表达了ASFV CD2v蛋白胞内域和胞外域,前者的抗原性比后者高,CD2v胞内域作为ASFV免疫学检测技术研究与开发的靶标更具优势。该研究结果对ASFV检测方法的研究与开发具有重要指导意义。

非洲猪瘟病毒CD2v蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

本研究以原核系统表达的非洲猪瘟病毒CD2v膜内区重组蛋白为免疫原接种BALB/c小鼠,经过细胞融合、间接ELISA筛选和多次亚克隆获得了8株能够稳定分泌CD2v蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系,分别命名为RH1、RH3、RH4、RH5、RH6、RH8、RH9和RH10。8株单克隆抗体的轻链类型均为Kappa型,其中RH1、RH5、RH9这3株单克隆抗体的重链亚型为IgG2b,其余5株单克隆抗体的重链亚型为IgG1。Western blot和免疫荧光试验证明获得的单克隆抗体具有良好的反应性,能特异地识别昆虫杆状病毒表达系统重组表达的CD2v蛋白,可为非洲猪瘟病毒结构蛋白的功能解析以及血清学诊断方法的开发提供重要的生物学材料。

非洲猪瘟病毒CD2v蛋白阻断ELISA候选单克隆抗体的筛选及免疫学特性鉴定

为制备非洲猪瘟病毒CD2v蛋白阻断ELISA候选单克隆抗体,并探究其免疫学特性,以真核表达的CD2v蛋白免疫BALB/c小鼠,经两次免疫后采集小鼠血清,以间接ELISA检测小鼠多抗血清效价。对血清效价最高的小鼠进行加强免疫后,取脾脏进行细胞融合。通过有限稀释法筛选能够稳定分泌CD2v单克隆抗体的杂交瘤细胞株。采用小鼠体内诱生腹水法和辛酸-硫酸铵法获得纯化的CD2v单克隆抗体,对其进行免疫学特性检测。间接ELISA试验显示,4号小鼠血清效价最高(1:72900),选取该小鼠脾脏进行细胞融合,经过筛选得到4株杂交瘤细胞,分别命名为21D10、21G8、36A3和38G8,亚型鉴定均为IgG_(1)/κ,经检测36A3 ELISA效价最高,可达1:2.187×10^(5)。免疫荧光试验显示,36A3抗体能与细胞内表达的CD2v蛋白发生特异性反应,而与携带His标签的p30蛋白无交叉反应;特异性鉴定结果显示,36A3抗体特异性良好,与猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒以及非洲猪瘟病毒p72蛋白均无反应;亲和力检测显示,36A3抗体亲和力较高,亲和常数(Ka)为9.68×10^(8)L/mol。初步建立的阻断ELISA试验显示,36A3能够有效区分阴阳性血清,N/P高达12.53,提示其为非常有效的阻断ELISA候选抗体。本试验结果为深入研究非洲猪瘟病毒CD2v蛋白功能及研发非洲猪瘟病毒阻断ELISA血清学检测试剂盒奠定了基础。

非洲猪瘟病毒CD2v胞内区蛋白间接ELISA方法的建立及初步应用

近年来,在全球范围内出现了EP402R基因(编码CD2v蛋白)缺失的ASFV突变毒株,因此需要开发一种检测方法来区分CD2v缺失的自然突变株和野生型ASFV毒株。对ASFV国内分离株WUHAN 2019-1株的EP402R基因序列,利用生物信息学分析其亲水性,选取可溶性较强部分(232~333 aa),根据大肠杆菌密码子偏嗜性对该段基因进行优化并人工合成,插入原核表达载体pET-28a进行低温表达,获得带有HIS标签的可溶性CD2v胞内区重组蛋白,将其命名为pET-28a-CD2v-IS,大小约15 ku。Western-blot鉴定结果显示,该重组蛋白抗原性良好。利用纯化后的CD2v重组蛋白建立了间接ELISA方法。经反应条件优化,最终确定最佳包被质量浓度为0.5μg/mL,封闭时间为1 h,样本最佳稀释度为1:10,样本最佳孵育时间为1 h,二抗最佳稀释度为1:20000,最佳孵育时间为45 min,底物孵育最佳时间为5 min;确定建立的间接ELISA方法的S/N临界判定值为1.61。试验灵敏性可达1:1280;批内变异系数小于4.15%,批间变异系数小于9.84%;只与ASFV全病毒株阳性血清发生反应,与ASFV(CD2v)缺失株、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等其他病毒阳性血清均无交叉反应;在检测46份背景清晰与54份背景未知的血清时,与商用试剂盒符合率分别达到100%与90.7%。结果表明,本研究建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、敏感性与重复性,检测结果与商品化试剂盒和WOAH推荐的间接ELISA方法一致,如果结合其他ASFV结构蛋白制成的ELISA检测试剂盒,可区分ASFV野毒与CD2v缺失株感染。

不同原核表达载体对非洲猪瘟病毒CD2v蛋白可溶性表达及免疫反应性比较

本研究旨在系统性地探究不同原核表达载体对非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的可溶性表达差别,并利用临床非洲猪瘟病毒抗体阳性血清比较包涵体和可溶性CD2v蛋白的免疫反应性。利用5种原核表达载体pCold-TF、pET28a、pMAL-C6T、pGEX-4T-1、pET32a分别表达去除信号肽和跨膜区的非洲猪瘟病毒CD2v蛋白,利用镍-氨三乙酸(nickel-nitrilotriacetic acid,Ni-NTA)亲和层析法分别纯化源自pET28a和pCold-TF表达载体的包涵体和可溶性CD2v蛋白,并用间接酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法比较纯化蛋白的免疫反应性。结果显示,pCold-TF载体以表达可溶性蛋白为主,pMAL-C6T载体同时表达包涵体和可溶性蛋白,而其他载体主要表达包涵体蛋白。临床非洲猪瘟病毒抗体阳性血清检测数据显示,可溶性蛋白的免疫反应性显著优于包涵体蛋白(P<0.05)。pCold-TF载体的触发因子(trigger factor,TF)标签可促进CD2v蛋白的可溶性表达,其表达蛋白的免疫反应性优于包涵体蛋白。本研究结果为CD2v蛋白的免疫原性研究奠定了基础,亦为其他重要抗原的可溶性表达提供了思路。

非洲猪瘟病毒CD2v重组蛋白真核表达及单克隆抗体的制备

本研究目的为表达非洲猪瘟病毒CD2v蛋白作为抗原,制备鼠源性CD2v单克隆抗体。以ASFV-SY18分离株为模板合成EP402R基因,构建pcDNA3.1-His真核表达载体,通过Expi-CHO表达系统获得重组CD2v蛋白,应用细胞融合技术制备杂交瘤细胞并筛选出单克隆抗体细胞株。实验结果显示,截短EP402R基因成功克隆至表达载体,构建出pcDNA3.1-CD2v-His质粒,转染至CHO细胞后收获重组蛋白,使用镍亲和层析法纯化带有His标签的CD2v蛋白。经SDS-PAGE及Western blot确认,CD2v蛋白大小为55 kDa且与免疫小鼠血清反应良好。共筛选出3株杂交瘤细胞株分别命名为2D6、4B2及4G12。间接ELISA鉴定3株杂交瘤细胞所制备的腹水效价均高达1∶12800,Western blot及间接免疫荧光实验证明3株单克隆抗体均可特异性识别重组CD2v蛋白。本研究成功制备了CD2v重组蛋白及其特异性单克隆抗体,为开发竞争性ELISA诊断方法及ASFV野毒鉴定奠定了基础。

表达非洲猪瘟病毒CD2v蛋白重组腺病毒的构建及其吸附红细胞特性的研究

为构建表达非洲猪瘟病毒(ASFV)CD2v蛋白的复制缺陷型重组腺病毒,本研究将ASFV EP402R基因融合猪泛素(Ub)基因,并经密码子优化后整合至人复制缺陷性5型腺病毒(Ad5)骨架质粒,经Pac I酶切线性化后转染293A细胞,拯救重组腺病毒(Ad5-CD2vUb-YH),结果显示,在转染8 d后出现典型细胞病变,且经测序鉴定显示插入片段与预期一致,表明拯救出一株重组腺病毒Ad5-CD2vUb-YH。利用Adeno-X快速滴度试剂盒测定F1~F3代Ad5-CD2vUb-YH的滴度,结果显示F1~F3代Ad5-CD2vUb-YH的滴度分别为1.36×10^(8)IFU/mL、1.47×10^(8)IFU/mL、2.16×10^(8)IFU/mL。利用直接免疫荧光试验(DFA)和western blot对F3代Ad5-CD2vUb-YH在Vero细胞中CD2v蛋白的表达进行鉴定,DFA鉴定结果显示感染Vero细胞的Ad5-CD2vUb-YH能与V5-FITC抗体特异性结合,细胞质内呈现特异性绿色荧光信号;Western blot鉴定结果显示感染Vero细胞的Ad5-CD2vUb-YH能与V5-HRP抗体和ASFV阳性血清均可进行特异性反应,在约102 ku和31 ku处均可见两条特异性条带,以上结果均表明CD2v蛋白得到了有效表达;进一步利用蛋白质谱对CD2v蛋白位置的胶块进行肽段序列测定并分析,结果显示其肽段序列与数据库中ASFV CD2v蛋白氨基酸序列匹配度为11%。对F3代Ad5-CD2vUb-YH感染293A细胞后吸附猪红细胞的能力进行鉴定,结果显示,Ad5-CD2vUb-YH表达的CD2v蛋白具有吸附红细胞的特性。本研究首次获得了一株重组腺病毒Ad5-CD2vUb-YH,其表达的CD2v蛋白与ASFV的CD2v蛋白特性完全一致,为ASFV CD2v蛋白吸附红细胞功能域的研究和ASFV重组腺病毒载体疫苗的研制奠定了基础。

表达非洲猪瘟病毒外膜蛋白CD2v的重组伪狂犬毒株的构建

为了构建表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)外膜蛋白CD2v的重组伪狂犬毒株并研究其生物学特性,试验利用RED/ET同源重组技术和ccdB反向筛选技术将EP402R pUC57-CMV-Flag-EP402R-BGH质粒(EP402R序列来源Georgia 2007/1株,GenBank登录号为FR682468)的EP402R基因片段替换掉pBeloBAC11-Bartha-K61载体中的TK基因片段,构建pBeloBAC11-Bartha-K61-(TK)CMV-Flag-EP402R-BGH重组质粒;再将该重组质粒转染至Vero细胞中进行病毒拯救,通过观察细胞病变、PCR方法和Western-blot鉴定得到重组伪狂犬毒株rBartha-K61-EP402R,并对其稳定性和增殖特性进行研究。结果表明:构建的重组伪狂犬毒株连续传代20次后仍能检测到EP402R基因和Flag标签蛋白;重组伪狂犬毒株与亲本毒株的增殖曲线保持一致,且病毒效价峰值可达到1×10^(5.6)TCID_(50)/mL。说明试验成功构建了表达ASFV外膜蛋白CD2v的重组伪狂犬毒株,且该毒株具有良好遗传稳定性和增殖性能。

基于ASFV EP402R编码蛋白CD2v的生物信息学分析

为深入了解非洲猪瘟病毒(ASFV)的EP402R编码蛋白CD2v结构与功能的关系和病毒-宿主作用机制,本研究通过在线工具对Pig/HLJ/2018中国分离株CD2v蛋白进行了遗传进化和生物信息学分析。结果显示:Pig/HLJ/2018株与格鲁吉亚Georgia 2007、Georgia 2008以及其他中国毒株处于同一分支,基因型同为Ⅱ型;同一基因型CD2v蛋白氨基酸序列一致性高达100%,不同基因型间蛋白氨基酸序列表现出差异,氨基酸一致性在76.8%~81.7%之间;该CD2v蛋白表达的蛋白大小为41.00889 kD;蛋白结构主要以无规卷曲为主;存在信号肽和跨膜区;存在4个优势B细胞表位和5个T细胞表位。结果表明:当前中国流行株为基因Ⅱ型;CD2v蛋白在ASFV入侵机体、免疫逃逸等过程中扮演重要角色,为ASFV的深入研究和ASF的防治奠定了基础。

非洲猪瘟病毒强免疫原性重组CD2v抗原的制备与初步应用

旨在获得非洲猪瘟病毒(ASFV)强免疫原性重组CD2v抗原,利用生物信息学软件进行CD2v抗原指数分析,将其细胞质内免疫显性区与类弹性蛋白多肽(ELP)在重组大肠杆菌中进行融合表达,对ELP-CD2v融合蛋白的相变循环(ITC)条件进行优化,在优化条件下进行融合蛋白纯化,利用烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶活性包涵体切除ELP标签,通过免疫转印法对重组CD2v抗原进行鉴定,利用重组CD2v抗原建立ELISA抗体检测方法,与多抗原ELISA对ASFV抗体阳性和阴性血清进行平行检测。结果显示,ELP-CD2v融合蛋白获得正确、可溶性表达,ITC条件为28℃和1.5 mol·L^-1 NaCl,在0.2%Triton X-100存在下进行ITC,纯化的融合蛋白纯度为76.3%;TEV蛋白酶活性包涵体能有效切割ELP标签,再次ITC回收的重组CD2v抗原纯度为91.7%,能被ASFV抗体识别;根据多抗原ELISA检测结果选择血清样品,用重组CD2v抗原ELISA进行检测,结果显示,15份ASFV抗体阴性血清均为CD2v抗体检测阴性,15份ASFV抗体阳性血清均为CD2v抗体检测阳性。这些研究结果表明,ASFV的CD2v蛋白胞内区存在强免疫原性表位,其重组抗原有望用于CD2v的抗体检测。

非洲猪瘟病毒Georgia 2007/1株CD2v蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

本研究旨在通过原核表达系统表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)Georgia 2007/1株EP 402 R基因,获得其编码的CD2v重组蛋白,并针对纯化的CD2v重组蛋白制备多克隆抗体。将ASFV EP 402 R全长基因进行密码子优化后连入pET-28a(+)表达载体,构建原核重组表达质粒,经1 mmol/L IPTG于16℃诱导12 h后,利用SDS-PAGE和Western blotting对重组蛋白进行表达鉴定和反应原性分析。以纯化的CD2v重组蛋白为免疫原制备鼠源抗CD2v多克隆抗体,随后以间接ELISA方法、间接免疫荧光试验及Western blotting分别检测多克隆抗体的效价和特异性。结果显示,ASFV EP 402 R基因克隆至pET-28a(+)获得pET-28a-EP402R重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后经诱导表达获得CD2v重组蛋白,其大小约为47 ku,重组蛋白主要以包涵体形式存在,部分也可以融合表达蛋白形式存在。Western blotting结果显示,其可溶性上清经镍柱纯化后能被ASFV阳性血清识别,具有良好的反应原性。间接ELISA检测该多克隆抗体效价可达1∶512000,间接免疫荧光试验和Western blotting表明该多克隆抗体可特异性识别真核表达的CD2v蛋白。以上结果表明,通过原核表达的ASFV CD2v重组蛋白具有较好的免疫原性,利用重组蛋白制备的多克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性,为进一步研究ASFV EP402R生物学功能及基因缺失毒株的鉴别诊断和疫苗开发提供技术储备。

非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的生物信息学分析及多表位疫苗的设计

本试验运用各种生物信息学技术对非洲猪瘟病毒(ASFV)Georgia 2007/1株CD2v蛋白的理化性质、信号肽、跨膜区、抗原决定簇、抗原性、二级及三级空间结构进行初步分析并预测其B、T淋巴细胞的优势表位,从而设计以pET28a为载体的重组CD2v蛋白的多表位疫苗。评估结果表明,CD2v蛋白是亲水性的分泌蛋白,含有11个抗原决定簇,其α螺旋、β转角、无规则卷曲和延伸链的比例为17.22%、5.28%、50.00%和25.70%。基于CD2v蛋白的多表位疫苗稳定性强,具有免疫原性且为非过敏原,有望成为防控非洲猪瘟的一种有效手段。

表达非洲猪瘟病毒CD2v与P12蛋白的重组伪狂犬病毒的构建

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)与伪狂犬病(pseudorabies,PR)分别由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)与伪狂犬病毒感染(Pseudorabies virus,PRV)引起的猪(或部分猪)高致死、传染性疾病。目前非洲猪瘟无商业化疫苗,两种疾病均给养猪业造成了巨大的经济损失。本研究以PRV-Fa经典毒株为载体通过CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9)基因编辑技术将ASFV(Pig/HLJ/18)CD2v(EP402R)与p12(O61R)基因分别插入PRV-Fa株TK(UL23)及gI(US7)基因位点中,成功构建TK及gI缺失且重组表达ASFV CD2v与P12的重组弱毒株PRV-∆gI(P12)-∆TK(CD2v)。通过基因测序、蛋白质免疫印迹(Western blot)与免疫荧光表明重组毒株遗传性状稳定且CD2v与P12在Vero细胞中稳定表达。通过一步生长曲线、噬斑生长测定、小鼠毒力测试及小鼠病理学评估表明与野生型毒株PRV-Fa相比重组毒株毒力明显减弱,对小鼠不具致死能力,该重组毒株为研究预防PR及ASF的新型疫苗提供了新的选择。

非洲猪瘟病毒结构蛋白CD2v的功能研究进展

非洲猪瘟是一种由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的急性、高致死性的猪传染病。ASFV至今尚未研发出有效的ASFV疫苗,给家畜养殖业造成了巨大的经济损失。ASFV编码的结构蛋白CD2v在病毒的复制、体内播散和免疫逃逸等方面发挥着重要作用。本文将综述CD2v的功能,同时讨论CD2v在疫苗研究和病毒基因分型中的应用。

非洲猪瘟病毒CD2v抗体间接ELISA方法的建立及其初步应用

为建立血清中非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,研究真核表达ASFV CD2v重组蛋白,并以纯化的蛋白为包被抗原,通过反应条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种快速的ASFV间接ELISA检测方法。通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定抗原的最佳包被浓度为10μg/mL,待检血清的最佳稀释倍数为1∶25,最佳封闭液为1%BSA与明胶封闭缓冲液,酶标抗体最佳稀释度为1∶2000,最优二抗稀释液为PBST,以此建立的ASFV间接ELISA方法临界值为0.366。该方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、口蹄疫病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性。该方法检测ASFV阳性血清灵敏度可达1∶50,批内重复性和批间重复性变异系数分别为2.2%~9.4%和4.7%~8.1%。试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,可初步应用于ASFV抗体检测。

非洲猪瘟病毒CD2v阻断ELISA检测方法的初步建立与应用

为了建立特异性检测CD2v抗体的非洲猪瘟病毒(ASFV)阻断ELISA方法,以杆状病毒表达的CD2v蛋白作为包被抗原,以抗ASFV CD2v蛋白的特异性阻断单克隆抗体为检测抗体,经过条件优化以及敏感性和特异性检测,建立了特异性检测CD2v抗体的ASFV阻断ELISA方法。结果显示,建立的阻断ELISA的最佳抗原包被量为20 ng/孔,待检血清样本最佳稀释度为1∶1,酶标抗体最佳稀释度为1∶10000。当血清样品的PI≥41.23%时,判定结果为CD2v抗体阳性,当血清样品的PI<41.23%时,判定结果为CD2v抗体阴性。特异性试验结果显示,该方法仅能与ASFV阳性血清反应,与伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒和猪瘟病毒等猪病病毒疫苗毒阳性血清无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法最低能检测出128倍稀释的阳性血清;批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%;对64份猪血清样品盘样品进行检测,结果显示符合率为96.88%。上述结果表明,本研究中建立的基于CD2v蛋白的ASFV阻断ELISA方法,联合p30等ASFV抗原血清学诊断方法可以用于CD2v缺失毒株的鉴别检测,为我国出现的ASFV CD2v缺失毒株的流行病学调查及疫情监测提供有效的检测技术。

CpG和ICTYOLANE^(TM)31佐剂对ASFV-CD2v蛋白免疫效果的影响

探讨CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG oligodeoxynucleotides,CpG ODN)和ICTYOLANE^(TM)31微乳佐剂对重组表达的ASFV-CD2v蛋白在小鼠体内免疫效果的影响。以杆状病毒表达的CD2v蛋白为抗原,分别配伍CpG寡脱氧核苷酸(CpG oligonucleotide,CPG ODN)和ICTYOLANE^(TM)31微乳佐剂,皮下免疫BALB/c小鼠。首次免疫后14 d进行二免,采集首免后0、14 d以及二免后7、14及28 d血清,通过间接ELISA检测血清中CD2v抗体水平;采集二免后35 d小鼠分离脾脏淋巴细胞,通过流式细胞术分析IFN-γ水平。结果显示,间接ELISA结果显示在二免后7 d可检测到较高水平的CD2v抗体,ICTYOLANE^(TM)31佐剂和CPG ODN佐剂组抗体水平明显高于蛋白组。T细胞亚群分析结果显示,在二免后35 d,CpG ODN佐剂组的CD4^(+)T淋巴细胞的比例最高,达到81.34%,ICTYOLANE^(TM)31佐剂组CD8^(+)T淋巴细胞的比例最低,仅为11.37%。ICTYOLANE^(TM)31佐剂组CD4^(+)/CD8^(+)比值最高,ICTYOLANE^(TM)31佐剂组CD4^(+)T细胞IFN-γ分泌水平最高,可达9.07%,但CpG ODN佐剂组、ICTYOLANE^(TM)31佐剂组及蛋白组间差异不显著。推断,小鼠在第二次免疫后7 d产生了较高水平的抗体,CpG ODN、ICTYOLANE^(TM)31佐剂对ASFV-CD2v蛋白均可增强免疫小鼠产生CD2v抗体的水平,其中CpG ODN佐剂作用更强。ICTYOLANE^(TM)31佐剂及CpG ODN佐剂可以增强机体细胞免疫,其中ICTYOLANE^(TM)31佐剂作用更强。该研究为非洲猪瘟亚单位疫苗相关佐剂的筛选提供了一定参考。

非洲猪瘟病毒CD2v胞外区蛋白的真核表达及其单克隆抗体的制备与功能分析

目的利用真核表达系统制备非洲猪瘟病毒(ASFV)CD2v分子N端胞外区融合蛋白,并作为抗原免疫和筛选特异性识别CD2v单克隆抗体。方法以pcDNA3.1-CD2v-HA质粒(含ASFV-BA71v株EP402R基因全长编码序列和HA标签)为模板,扩增CD2v蛋白胞外区碱基序列,构建真核表达载体pcDNA3.1-N-CD2v-His,通过Expi-293表达系统获得重组N-CD2v-His蛋白。将纯化后的蛋白免疫小鼠,利用杂交瘤细胞技术制备特异识别CD2v分子单克隆抗体,对获得的抗体经酶联免疫吸附实验(ELISA)、Western印迹以及间接免疫荧光等方法进行鉴定。结果N-CD2v-His融合蛋白基因被成功构建到真核表达载体上,转染Expi-293F细胞收获重组蛋白,纯蛋白经SDS-PAGE分析发现,N-CD2v-His融合蛋白条带呈高度糖基化修饰的梯状分布。用该融合蛋白免疫小鼠,经杂交瘤细胞筛选,获得2株高亲合活性单克隆抗体,2株抗体经间接ELISA、Western印迹及免疫荧光实验等检测均能特异识别糖基化修饰的CD2v全长蛋白。结论成功制备了抗CD2v特异性单克隆抗体,为进一步开发新型ASFV抗原检测或治疗方法奠定了基础。

非洲猪瘟CD2v截短蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

为建立非洲猪瘟(ASF)抗体检测方法,本研究根据ASFV HLJ18株基因组序列合成CD2v蛋白的胞外区段基因序列,连接至原核表达载体pET28a,构建表达质粒pET28a-CD2v。经测序鉴定正确后转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)pLysS,构建表达菌株p ET28a-CD2v/BL21(DE3)PLysS。经IPTG诱导和镍柱纯化后,获得纯化的CD2v蛋白并经SDS-PAGE和Westernblot鉴定。以纯化的CD2v蛋白作为包被抗原,通过优化反应条件建立检测CD2v抗体的间接ELISA方法,并评价该方法的特异性、敏感性和重复性及在临床血清中的应用。结果显示,经测序构建的表达质粒序列正确,CD2v蛋白表达经SDS-PAGE可见略小于25k Da的条带,Westernblot显示能与ASFV感染血清发生特异性反应。建立了ASFCD2v蛋白抗体检测方法CD2v-ELISA,抗原包被质量浓度为50μg/L,血清稀释倍数为1∶100,羊抗猪HRP-IgG稀释倍数为1∶100000,阴阳性临界值为0.26;与PRRSV、CSFV、PRV(g I)、PRV(gb)、FMDV血清不发生反应,具有良好的特异性;ASF阳性血清稀释至128000倍后仍检测为阳性,具有较高的敏感性;重复性结果显示,批间和批内变异系数均小于10%。使用CD2v-ELISA检测154份临床血清,阳性结果74份,阳性率为48.05%。与2个国产、2个进口商品化ASFV抗体试剂盒的检测结果比较,CD2v-ELISA方法跟其他方法的符合率较高,分别为95.45%,94.16%,88.31%,93.51%。因此,本研究成功建立了基于CD2v胞外区段抗原的ELISA方法,可用于ASF临床抗体的检测。

猪CD1d蛋白多克隆抗体的制备及应用

[目的]制备猪源CD1d的多克隆抗体,为探究猪CD1d蛋白在非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染过程中的功能奠定基础。[方法]利用PCR方法扩增了猪CD1d基因,并将其同源重组至pGEX-6p1载体中,构建了原核重组表达质粒pGEX-6p1-CD1d。将重组质粒转化E.coli BL21(DE3)并用IPTG进行诱导表达,表达的GST-CD1d重组蛋白经SDS-PAGE和Western blot(WB)方法鉴定,SDS-PAGE结果显示约50 ku处有一条明显的条带,该蛋白以包涵体形式表达。然后利用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析方法进行蛋白纯化,将纯化的GST-CD1d蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化后,将纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,采用颈背部多点皮下注射,免疫剂量为200μg/只,首免后第3周和第5周分别进行二免和三免,均采用弗氏不完全佐剂乳化,方法和剂量与首免相同。三免后第7天,通过耳缘静脉采血分离血清。首免后第7周进行第四次免疫,一周后心脏采血。该抗体经Protein G亲和层析纯化后冻存于-80℃冰箱。通过WB和间接免疫荧光(IFA)鉴定瞬时转染表达的外源CD1d蛋白和猪原代巨噬细胞(PAMs)表达的内源CD1d蛋白的表达与细胞定位情况。同样,制备的CD1d抗体可以将外源瞬时转染表达的CD1d通过IP拉下。为了探究CD1d在ASFV感染早期的情况,将ASFV接种于PAMs,制备ASFV感染0、15、30、60 min的样品,以CD1d为一抗,通过WB检测了CD1d蛋白的表达情况。在HEK293T细胞共转pCAGGS-HA-CD1d和pCAGGS-Flag-CD2v质粒,24 h后收取细胞裂解,加入Flag beads过夜结合蛋白,通过WB检测互作情况染,同时,质粒共转染于共聚焦小皿中的HEK293T细胞,用标签抗体对其进行孵育,选择相应的荧光二抗,通过激光共聚焦显微镜观察CD1d与CD2v在细胞中共定位情况。采用Co-IP验证CD1d与ASFV外囊膜蛋白CD2v的相互作用。[结果]原核表达的GST-CD1d蛋白以包涵体形式表达在感受态细胞中,分子质量约为35 ku;实验兔4次免疫CD1d重组蛋白后采血并分离血清,纯化的抗体经SDS-PAGE检测在45和25 ku处各出现一条特异性条带,分别为CD1d抗体的重链与轻链。以纯化的CD1d蛋白作为免疫原制备的兔抗CD1d抗体包含重链和轻链,且具有较好纯度;该抗体能够通过WB和IFA鉴定瞬时转染的外源以及PAMs内源CD1d蛋白的表达和细胞定位。进一步检测结果显示,ASFV感染PAMs后,CD1d蛋白表达水平明显增加,并且WB和IFA结果显示CD1d与ASFV编码的外囊膜蛋白CD2v存在相互作用和共定位。[结论]通过原核表达技术制备了CD1d的抗体,为进一步探究CD1d蛋白在ASFV感染过程中的生物学功能打下了基础。