高纯度CD3^-CD56^+CD16^+NK细胞体外扩增技术的研究

本研究探索高纯度CD3-CD56+CD16+NK细胞体外扩增技术。应用免疫磁珠分选法(MACS)分离出高纯度的CD3-CD56+CD16+NK细胞,置于含10%人AB血清的造血干细胞培养基(SCGM)中,加入细胞因子IL-2、IL-15、SCF组成不同培养体系进行体外扩增。采用细胞计数法、流式细胞术免疫表型分析和CCK-8试剂盒检测对K562细胞的杀伤率等方法比较不同培养体系对NK细胞增殖前后的数量、纯度及杀伤活性的影响;并采取相同方法对IL-2的浓度与NK细胞增殖效率及杀伤活性之间的关系进行探讨。结果发现,经免疫磁珠分选法所得的高纯度CD3-CD56+CD16+NK细胞扩增18天后,IL-2/IL-15/SCF组扩增倍数显著高于其他组(p<0.05);含细胞因子组的NK细胞对K562细胞的杀伤活性显著提高,尤其是IL-2/IL-15组和IL-2/IL-15/SCF组在效靶比10∶1时杀伤活性均高达90%以上。低、中、高浓度IL-2组扩增倍数之间比较差异无显著性(p>0.05),而在对K562细胞杀伤率的比较上,高浓度组明显高于低、中浓度组(p<0.05)。结论:在10%人AB血清的SCGM中加入IL-2/SCF/IL-15细胞因子组合,可使经MACS纯化的NK细胞在体外高效地活化及增殖;本培养体系中IL-2浓度较低(<1 000U/ml)时,NK细胞的扩增效率及对K562细胞的杀伤率与IL-2的浓度高低无相关性;而高浓度的IL-2(≥1 000U/ml)可进一步激活纯化后NK细胞的体外杀伤活性。

CD3^-CD16^+CD56^+NK细胞水平变化在急性胰腺炎严重程度预测中的作用

目的分析急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)发病早期CD3^-CD16^+CD56^+NK细胞计数在AP严重程度预测中的作用。方法采用流式细胞仪荧光抗体标记法分别对164例AP患者的外周血单核细胞进行CD3、CD16、CD56荧光抗体标记,分析比较AP患者CD3^-CD16^+CD56^+NK细胞在外周血单核细胞中的百分比和计数情况,及其与AP严重程度的关系。用ROC曲线和AUC评价CD3^-CD16^+CD56^+NK细胞在外周血单核细胞中的百分比和计数对SAP的诊断价值。结果与正常对照组相比,MAP组、MSAP组和SAP组的CD3^-CD16^+CD56^+百分比和计数均显著下降,各组间差异有统计学意义(P<0.05)。CD3^-CD16^+CD56^+细胞百分比的AUC为0.86(95%CI:0.745~0.973),取值≤5.27%时,特异性为0.92,敏感性为0.79;CD3^-CD16^+CD56^+细胞计数的AUC为0.89(95%CI:0.808~0.961),取值≤0.056×109/L时特异性为0.90,敏感性为0.79。结论 CD3^-CD16^+CD56^+NK细胞在外周血单核细胞中的百分比和细胞计数对SAP早期诊断有一定的价值。

系统性红斑狼疮患者外周血CD3^-CD16^+CD56^+NK细胞水平变化的临床意义

分析系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血CD3^-CD16^+CD56^+NK细胞水平变化。94例SLE患者作为研究对象,另选取同期健康体检者50例为对照组。结果显示SLE组CD3^-CD16^+CD56^+NK细胞计数和百分率均明显低于对照组(P<0.05);Pearson积差分析显示CD3^-CD16^+CD56^+NK细胞计数与SLEDAI评分和24 h尿蛋白定量呈明显负相关性(P<0.05);以8.04%为临界值,CD3^-CD16^+CD56^+NK细胞计数判断SLE活动性的灵敏度为57.78%,特异度为78.57%,AUC为0.677。实验表明SLE患者外周血CD3^-CD16^+CD56^+NK细胞表达明显减少,观察其表达水平变化可为判断病情活动度和肾功能损害提供参考依据。

原因不明习惯性流产患者外周血CD3^+CD16^+CD56^+自然杀伤T细胞的表达及意义

目的探讨自然杀伤T细胞(natural killer T cell,NKT)在原因不明习惯性流产(unexplained recurrent spontaneous abortion,URSA)发生机制中的作用。方法有URSA史患者50例,其中未孕者20例为URSA非孕组,难免流产者30例为UESA难免流产组,52例正常体检者中正常未生育者20例为正常未育组,正常妊娠孕妇20例为正常妊娠组,有正常生育史12例为正常生育组,采用流式细胞术检测各组外周血中CD3+CD16+CD56+NKT细胞的表达水平。结果外周血CD3+CD16+CD56+NKT细胞百分率正常未生育组[(4.62±1.38)%]与正常生育组[(4.90±3.00)%]比较差异无统计学意义(P>0.05);URSA非孕组外周血CD3+CD16+CD56+NKT细胞百分率[(2.42±1.52)%]低于正常生育组(P<0.05),URSA难免流产组[(4.18±2.77)%]低于正常妊娠组[(14.40±2.27)%](P<0.05);正常妊娠组外周血中NKT细胞百分率是正常生育组的3倍,而URSA难免流产组是URSA非孕组的2倍。结论 URSA患者外周血NKT细胞表达水平降低,NKT细胞可能参与了URSA的发生。

CD3^-CD16^+CD56^+NK细胞与系统性红斑狼疮活动的相关性研究

目的探讨SLE患者外周血CD3^-CD16^+CD56^+NK细胞的表达水平及其临床意义。方法流式细胞术检测134例SLE患者、90名健康对照外周血CD3^-CD16^+CD56^+NK细胞计数及占淋巴细胞百分比,ELISA法测定血清抗核抗体、抗dsDNA抗体、抗C1q抗体水平;Logistic多元逐步回归分析SLE患者疾病活动的独立危险因素,Pearson或Spearman相关分析CD3^-CD16^+CD56^+NK细胞与SLE患者临床指标的相关性,多元逐步回归分析影响CD3^-CD16^+CD56^+NK细胞的独立危险因素。结果SLE患者外周血CD3^-CD16^+CD56^+NK细胞计数和占淋巴细胞百分比[(151±126)%,(10±7)%,134例]均低于健康对照组[(404±261)%,(19±9)%,90名](t=-12.218,P<0.01;t=-9.606,P<0.01)。活动组SLE患者外周血CD3^-CD16^+CD56^+NK细胞计数和占淋巴细胞百分比[(94±67)%,(9±6)%,54例],均低于非活动组[(189±142)%,(11±6)%,80例](t=-4.586,P<0.01;t=-2.241,P=0.027)。外周血CD3^-CD16^+CD56^+NK细胞计数和百分比、病程、尿蛋白定量(24 h)、ESR、C4均与SLE患者疾病活动的独立相关(OR=0.990、0.936、0.979、1.813、1.040、0.183,P均<0.05)。而SLEDAI评分与SLE患者CD3^-CD16^+CD56^+NK细胞计数独立相关(β=-0.358,P<0.01)。结论SLE患者外周血中CD3^-CD16^+CD56^+NK细胞计数及百分比是SLE患者疾病活动的独立危险因素,外周血CD3^-CD16^+CD56^+NK细胞下降可能在SLE发生、进展中扮演重要角色。

化疗及胸腺肽α1对恶性肿瘤患者细胞免疫功能的影响及意义的临床研究

目的探讨化疗及胸腺肽α1对恶性肿瘤患者细胞免疫功能的影响及意义。方法 130例恶性肿瘤患者在化疗前一周及化疗2周期后分别检测外周血T细胞亚群(CD_3^+、CD_4^-、CD_8^+)B细胞(CD_(19)^+)NK细胞(CD_3^-/CD_(16)^-CD_(56)^+),并比较化疗前后的变化,随后随机分为A、B两组,在其他治疗相同的前提下,A组给予胸腺肽α11.6mg QodIH,2～6个月,B组不用胸腺肽α1治疗,2月后两组均行细胞免疫功能(CD_3^+、CD_4^+、CD_8^+、CD_(19)^+、CD_3/CD_(16)CD_(56)^+)测定。结果恶性肿瘤患者化疗后细胞免疫功能比较CD_3^+、CD_4^+细胞升高,CD_8^+细胞下降(P>0.05),CD_4^+/CD_8^+显著升高(P<0.05);A组与B组相比A组的CD_3^+、CD_4^+、CD_8^+、CD_4^-/CD_8^+、NK细胞活性较治疗前显著提高(P<0.05),B组各项指标治疗前后无显著差异(P>0.05)。结论化疗不会完全破坏机体的免疫功能,而会使部分免疫功能提高及调整;胸腺肽α1可以提高肿瘤患者的细胞免疫功能,从而增强抑瘤作用。

外周血自然杀伤T细胞与原因不明复发性流产的相关性分析

目的探讨外周血自然杀伤T (NKT)细胞的水平与原因不明复发性流产(URSA)的相关性,为临床诊治提供参考依据。方法选取确诊为URSA的患者35例,其中怀孕者14例为URSA怀孕组,未孕者21例为URSA非孕组;选取37例正常体检者,其中正常怀孕者16例为正常妊娠组,未生育过的妇女11例为正常未生育组,有过妊娠史的10例为正常已生育组。采用流式细胞仪测定各组外周血中的CD3^+、CD3^+CD16^+CD56^+、CD3^+CD16-CD56^+细胞的表达水平。结果 URSA怀孕组孕妇的外周血NKT细胞比其他4组都高,且差异有统计学意义(均P<0. 05);正常妊娠组妇女外周血NKT细胞比URSA非孕组、正常未生育组、正常已生育组都高,且差异有统计学意义(均P<0. 05);而URSA非孕组与正常未生育组、正常已生育组之间的NKT细胞差异无统计学意义(均P>0. 05)。5组妇女的CD3^+和CD3^+CD16-CD56^+细胞水平差异无统计学意义(均P>0. 05)。结论 URSA患者怀孕时外周血中的NKT细胞表达水平上升,NKT细胞可能参与了URSA的发生。

小叶女贞对免疫功能损伤小鼠B淋巴细胞和NK细胞的影响

目的探讨小叶女贞对免疫功能损伤小鼠B淋巴细胞、NK细胞免疫功能的影响。方法以环磷酰胺致免疫功能损伤小鼠为研究对象，将BALB／C实验小鼠60只按随机数字表法随机分为5组，每组12只，分别为生理盐水（NS）对照组、环磷酰胺（Cy）对照组、Cy＋小叶女贞水煎液小剂量组（小叶女贞小剂量组）、Cy＋小叶女贞水煎液大剂量组（小叶女贞大剂量组）、Cy＋女贞子水煎液组（女贞子组）。NS对照组给予生理盐水0．2ml／d皮下注射10d，其余各组给予环磷酰胺0．8ml／d皮下注射（20mg／kg·d^-1）10d，建立免疫功能损伤小鼠模型。自第11天起各组分别给予生理盐水、环磷酰胺、小叶女贞水煎液小剂量、小叶女贞水煎液大剂量、女贞子水煎液共7天处死。用流式细胞仪检测实验鼠外周血B淋巴细胞（CD3^-CD19^＋）和NK细胞（CD3^-CDl6^＋CD56^＋）的百分率。结果CD3^-CDl9’、CD3^-CDl6^＋CD56^＋细胞小叶女贞小剂量组[分别为（11．54±0．98）、（12．46±0．08）]，明显低于小叶女贞大剂量组[分别为（20．44±1．78）、（19．12±1．70）]、女贞子组[分别为（19．90±1．42）、（20．17±1．66）]，明显高于环磷酰胺组[分别为（4．53±1．70）、（5．03±1．22）]，差异均有统计学意义（P均〈0．01）；与NS对照组[分别为（11．84±0．99）、（12．90±0．28）]比较无明显改变（P〉O．05）。结论小叶女贞能提高小鼠B淋巴细胞和NK细胞细胞的数量，使小鼠受损伤的免疫功能得到改善，对免疫功能的调节作用与剂量成正相关。

肾母细胞瘤患儿外周血调节性T细胞和自然杀伤T细胞的表达研究

目的研究肾母细胞瘤患儿外周血CD4^+CD25^+CD127^(low)调节性T细胞(Treg)和CD3^+CD16^+CD56^+自然杀伤T细胞(NKT)的表达变化,初步探讨发生改变的原因及其临床意义。方法选取2015年11月至2016年7月就诊的21例肾母细胞瘤患儿作为病例组,21例于本院体检的同年龄段健康儿童为健康对照组,采用流式细胞术检测两组儿童外周血中CD4^+CD25^+CD127^(low) T细胞占CD4^+T细胞百分比和CD3^+CD16^+CD56^+T细胞占CD3^+T细胞百分比,分别代表Treg水平和NKT水平。结果病例组肾母细胞瘤患儿外周血Treg水平低于健康对照组(P<0.05);病例组肾母细胞瘤患儿外周血NKT水平高于健康对照组(P<0.05)。结论 Treg和NKT水平变化与肾母细胞瘤的发生与发展有关,Treg和NKT水平可能是反映肾母细胞瘤患儿免疫功能状态的较好指标。

不同细胞因子组合对人自然杀伤细胞体外高纯度扩增的实验研究

目的探讨人自然杀伤细胞（NK）高效扩增培养技术，以获得一种优化的诱导扩增临床应用级别NK细胞的方法。方法提取健康人外周血单个核细胞（PBMCs），应用免疫磁珠分选法（MACS）阴性分离出高纯度的CD3-CD56＋CD16＋NK细胞，采用X-VIVO培养基，在均含有白细胞介素（IL）-2、CD3单抗的基础上用不同的细胞因子组合对其进行体外扩增和诱导。采用细胞计数法、流式细胞术免疫表型分析比较NK细胞增殖后的数量与NK细胞纯度。结果IL-7／IL-15／IL-21的优化组合刺激NK细胞增殖的效果为最佳，培养18d可使经免疫磁性珠阴性纯化的NK细胞扩增124倍，使未经纯化的PBMCs细胞增殖108倍。在NK细胞纯度方面，培养18d可使经免疫磁性珠阴性纯化的NK细胞扩增后的CD3-CD16＋CD56＋NK细胞纯度达81．5％，CD3-CD16＋CD56＋NK细胞阳性率为10．3％，NK细胞总纯度为91．8％；使未经纯化的PBMC细胞扩增后的CD3。CDl6＋CD56＋NK细胞纯度达22．1％，CD3＋CDl6＋CD56＋NK细胞阳性率为33．5％，NK细胞总纯度为55．6％。而单用不同细胞因子IL-7、IL-15、IL-21对NK细胞扩增数量和纯度均有所不同。结论采用X-VIVO培养基，在IL-2、CD3单抗的基础上加IL-7／IL-15／IL-21的优化组合刺激NK细胞增殖的数量和纯度达到最佳效果，所产生的NK细胞质量可满足临床细胞免疫治疗抗肿瘤应用的需要。