CAR-T细胞注射液工艺中CD3/CD28磁珠残留检测方法的建立

针对CAR-T细胞注射液工艺中用到的Dynabeads CD3/CD28的磁珠残留,建立一种灵敏且稳定可靠的检测方法。CAR-T细胞和细胞碎片本身会对Dynabeads磁珠的检测造成很大干扰,本研究首先需要用合适的溶剂裂解后去除细胞样品和细胞碎片,通过磁力架吸附住需要检测的磁珠残留,再采用光阻法,当液体中的微粒通过一窄细检测通道时,由于被微粒阻挡而减弱,由传感器输出的信号降低,这种信号变化与微粒的截面积大小相关,通过Beckman Coulter的HIAC 9703+不溶性微粒分析仪,进而检测CAR-T细胞注射液中的磁珠残留。经预验证,CAR-T细胞注射液中样品的专属性灵敏,重复性的RSD为9%,中间精密度RSD为12%,加标回收率在83%~101%,以及在室温放置3h,稳定性的回收率在95%~99%。本方法简便、灵敏、准确可用于CAR-T细胞注射液中用到的Dynabeads CD3/CD28磁珠残留的质量评估。

抗CD3/CD28单克隆抗体联合PHA对T淋巴细胞活化和增殖的影响

目的探讨抗人CD3/CD28单克隆抗体联合植物血凝素(PHA)对人外周血T淋巴细胞活化增殖的影响。方法通过Ficoll密度梯度离心法分离健康成人外周血单核细胞后,用CD3免疫磁珠分选T淋巴细胞,抗CD3/CD28单抗、PHA及重组人白介素-2(recombinant human IL-2,rhIL-2)刺激T淋巴细胞。用CCK-8试剂盒(CCK-8 cell counting kit)检测细胞增殖情况,ELISA测定细胞上清液干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ)的含量。结果CCK-8结果显示在增殖3 d时,CD3/CD28+PHA组A450 nm值与PHA组、IL-2组与空白组比较,差异有统计学意义(P<0.05);比较各组在6、9、12 d的增殖情况,CD3/CD28+PHA组的A450 nm值与其他各组差异均有统计学意义(P<0.05)。刺激3 d各组分泌的IFN-γ质量浓度是最高的。刺激9 d时,CD3/CD28+PHA组、CD3/CD28组、PHA组上清液中IFN-γ浓度分别为(235.27±27.80)、(189.23±24.79)和(124.66±3.39)pg/mL,CD3/CD28+PHA组上清液中IFN-γ的质量浓度高于其余2组(P<0.05)。结论抗CD3/CD28单抗联合PHA比单用抗CD3/CD28单抗、PHA或rhIL-2能更好地激活T细胞及持久地促使T细胞增殖。

抗CD28抗体协同刺激增强抗CD3抗体体外激活T淋巴细胞并降低TGF-β的表达

为了探讨体外激活T淋巴细胞的方法及活化后T淋巴细胞的免疫学特征,利用抗CD3、抗CD28抗体在体外刺激健康人外周血单个核细胞PBMNC,检测淋巴细胞转化,CD8+CD25+细胞比例和肿瘤生长因子β(TGF-β)表达等相关免疫学指标。结果表明,在抗CD28抗体的协同作用下,抗CD3抗体的刺激活性明显提高,CD8+CD25+细胞比例明显增加,TGF-β的表达下调。结论:抗CD28抗体协同刺激可以提供第二信号,使T淋巴细胞充分活化。

CD3和CD28单克隆抗体联合作用对CIK细胞及其亚群增殖及功能的影响

目的:探讨CD3和CD28单克隆抗体联合作用对细胞因子诱导的杀伤(cytokine-induced killer,CIK)细胞及其亚群增殖及功能的影响。方法:采集2014年6月至2015年6月在郑州大学第一附属医院接受生物细胞治疗的20例肿瘤患者(肾癌6例,肺癌5例,肝癌、乳腺癌和恶性黑素瘤各2例,胆囊癌、淋巴瘤和卵巢癌各1例)的外周血,每例外周血均分为4组(对照组,单用CD3单抗组,单用CD28单抗组,CD3和CD28单抗联合作用组)进行CIK细胞的诱导培养。用CFSE染色检测CIK细胞的增殖能力;ELISA检测CIK细胞分泌细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-2的水平;磁珠分选CIK细胞亚群CD4+、CD8+和CD56+细胞,然后用ELISA检测对CIK细胞亚群分泌IFN-γ、TNF-α和IL-2能力的影响。结果:CD3/CD28单抗联合作用(PI=59.35)对CIK细胞的增殖能力的影响与单独使用CD3单抗(PI=64.4)相比效果并不明显,但是可以刺激CIK细胞分泌较高水平的IFN-γ和TNF-α[IFN-γ:(384.6±263.1)vs(201.5±271.5)pg/ml,P=0.0361;TNF-α:(4.795±1.251)vs(2.835±0.443)pg/ml,P=0.0265];进一步分析发现,两单抗的联合作用可增强亚群细胞CD8+分泌IFN-γ、CD56+分泌IL-2和TNF-α的活性,从而起到对淋巴细胞功能的增强作用。结论:CD3与CD28单抗联合作用不能增强CIK的增殖能力,但可以在一定程度上增强CIK细胞的功能,在肿瘤的细胞免疫治疗应用中具有一定的潜力。

抑制性削减技术研究CD3/CD28单抗共刺激人T淋巴细胞基因差异表达

为了研究参与人T细胞活化、增殖、信号转导的相关基因,以正常人初始T细胞作为对照样本,以抗人CD3抗体联合抗人CD28抗体激发的人T细胞作为试验样本,进行抑制性削减杂交。结果筛选到43个侯选克隆,对其单向测序后,经过与GenBank同源序列比较,证实了6个克隆参与了T细胞活化增殖和信号转导的下游通路,分别为CCND2、Rho A、IRF4、FKSG44、EBP、PRPPS2;13个克隆所可能编码的基因与T细胞活化、分裂增殖、分化有关,另外24个克隆在GenBank无法查到对应的同源基因,可能代表了新基因。对这些基因的进一步研究,有助于阐释T细胞活化、增殖的信号转导机制,为了解体内活化T细胞参与的生理和病理过程,具有一定的指导意义。

CD8^+CD28^-Ts、CD3^+CD56+NKT细胞在B细胞非霍奇金淋巴瘤患者外周血中分布的分析

背景及目的:目前认为B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)常伴随免疫抑制,CD8+CD28-Ts(Ts)细胞和CD3+CD56+NKT(NKT)是新鉴定的新型免疫抑制性调节细胞,在肿瘤的免疫抑制及免疫逃逸机制中起重要作用,但它们在B细胞淋巴瘤患者外周血的分布情况及其免疫抑制中的作用目前尚不清楚。本文通过分析两者在化疗前及化疗后B-NHL患者外周血中比例及变化规律,初步探讨它们在B-NHL的免疫抑制作用及其影响因素,为有效干预患者的免疫功能提供参考。方法:应用流式细胞仪检测79例治疗前的B-NHL患者、经4～6周期化疗后完全缓解(CR)的18例患者、30例健康志愿者外周静脉血中NKT及Ts细胞的比例。结果:在79例治疗前B-NHL患者的外周血中,Ts细胞比例为(18.19±5.03)%,较正常对照组(11.20±3.49)%明显增高(P<0.01);NKT的比例为(6.08±3.29)%,亦较正常对照组的(3.52±1.56)%明显增高(P<0.01)。Ts在不同临床分期的患者之间无显著性差异P>0.05;Ⅰ期为(17.56±4.10)%、Ⅱ期为(18.05±5.64)%、Ⅲ期为(18.14±5.58)%、Ⅳ期为(18.95±4.64)%;在不同恶性程度的患者之间亦无显著性差异P>0.05;低度恶性为(17.81±5.24)%、中度恶性为(18.37±4.83)%、高度恶性为(18.31±5.93)%;在治疗前(18.64±4.55)%和CR后(19.42±4.95)

输血前后CD3/28双抗体活化外周血单个核细胞后细胞因子的变化

目的研究单独CD3抗体或联合CD28抗体作用于输血前后患者外周血单个核细胞(PBMC)后细胞因子的变化。方法体外T细胞培养与活化,采用酶联免疫法测定细胞因子IL-2、γ干扰素(IFN-γ)和IL-4的分泌水平。结果输血前患者PBMC单独应用CD3抗体与联用CD28抗体后,PBMC细胞因子分泌水平的变化无显著性,但输血后差异有显著性。结论CD28抗体可明显增强输血后体外活化T细胞功能,输血导致的免疫抑制作用可能与抗原提呈细胞的功能受到影响有关。

CD3+CD28+T细胞与晚期非小细胞肺癌化疗疗效的相关性研究

目的探讨CD3+CD28+T细胞与晚期非小细胞肺癌化疗疗效的相关性。方法 40例有可测量病灶的晚期非小细胞肺癌患者接受NP方案化疗,化疗前采用流式细胞术检测外周血CD3+CD28+T细胞的数值,进行有效组(CR+PR)、稳定组(SD)、进展组(PD)和正常对照组四组间比较,并进行疗效与CD3+CD28+T细胞值的相关性分析。结果化疗前有效组的CD3+CD28+T细胞值与对照组相比差异无统计学意义(P=0.158),稳定组和进展组均低于对照组(P=0.003,P=0.000);有效组明显高于稳定组和进展组(P=0.036,P=0.000),稳定组高于进展组(P=0.000)。疗效与CD3+CD28+T细胞数值的相关系数r=0.672(P=0.000)。结论化疗前CD3+CD28+T细胞检测值与化疗疗效有一定的相关性,化疗前CD3+CD28+T细胞数值高,则化疗效果好。

The effect of anti-CD28 on the CD3-AK proliferation and tumoricidal activity

Objective The aim of this study was to costimulate the CD3-AK cells with anti-CD28 monoclonal antibody (mAb), observe the effect of cell proliferation and cytotoxicity and explore the regulatory role of CD28 mAb on the CD3-AK tumoricidal activity.

协同刺激分子CD28/CTLA-4:B7在胃癌患者中的表达及临床意义

目的研究胃癌患者外周血共刺激分子CD28和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4 (CTLA-4,CD152)及B7分子的表达水平,以探讨胃癌患者共刺激通路是否异常以及在胃癌发病机制中的作用。方法用流式细胞仪检测56例胃癌患者外周血淋巴细胞表面的CD28、CD152、CD3、CD4、CD8及B7分子的表达,并与健康对照组及胃良性肿瘤组作比较。结果胃癌患者外周血中CD3^+、CD4^+、CD3^+CD28^+、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)的表达水平及CD4^+/CD8^+低于健康对照组及良性肿瘤组,CD3^+、CD152^+和CD8^+水平显著增高。结论胃癌患者外周血淋巴细胞低表达CD28和B7分子,高表达CTLA-4分子,导致了胃癌患者B7:CD28/CTLA-4共刺激通路异常,影响了T细胞彻底清除肿瘤细胞,从而使肿瘤逃避机体的免疫监视、免疫抑制,发生转移。

协同刺激信号α-CD28单抗增强肿瘤特异性CTL体内外的杀瘤活性

目的 采用α CD2 8单抗增强α CD3单抗刺激的肿瘤特异性T细胞的杀瘤活性。方法 采用 2种方案培养FBL 3免疫的小鼠脾细胞。 (1)使用α CD3单抗 48h后 ,加入α CD3单抗和 2 0U/mlrIL 2 (α CD3 +IL 2组 ) ;(2 )α CD3单抗和α CD2 8单抗同时使用 48h后 ,加入α CD3单抗、α CD2 8单抗和 2 0U/mlrIL 2 (α CD3+α CD2 8+IL 2组 )。3H TdR掺入法检测两组效应细胞的增殖水平。标准 4h 51Cr释放法检测两组效应细胞的杀伤活性。在培养第 12天 ,每只荷瘤小鼠过继转输 1× 10 7CTL ,观察小鼠的存活期。结果 α CD3 +IL 2组、α CD3+α CD2 8+IL 2组细胞的3H TdR掺入量分别为 8.36× 10 4 、1.31× 10 5,后者明显高于前者。在培养 12d时 ,效靶比为 12 .5∶1时 ,α CD3+IL 2组细胞对FBL 3的特异性杀伤活性为 35 .6 % ,α CD3 +α CD2 8+IL 2组细胞对FBL 3的特异性杀伤活性为 49.5 %。分别过继转输两组效应细胞治疗荷瘤小鼠 ,荷瘤小鼠的平均存活期分别为 16 .7和 2 0 .8d。结论 协同刺激信号α CD2

γ-氨基丁酸及其受体调控CD8^+T细胞活化

目的探讨γ-氨基丁酸(GABA)及受体对CD8^+T细胞增殖能力的影响。方法采用CD8^+T细胞磁珠分选试剂盒分选Balb/c小鼠脾脏的CD8^+T细胞;在CD3/CD28活化磁珠的作用下,以不同浓度的GABA刺激CD8^+T细胞,通过5-溴脱氧尿苷(Brd U)标记和流式细胞术检测CD8^+T细胞的增殖情况;通过实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)比较CD8^+T细胞活化前后GABA-A、GABA-B受体的表达。结果流式检测结果显示,GABA可抑制已活化的CD8^+T细胞的增殖,表现为CD152^+CD8^+T细胞明显减少;实时荧光定量PCR结果显示,仅在CD8^+T细胞活化时表达的GABA-A受体亚型为α2、α6和GABA-B受体亚型为1a;CD8^+T细胞活化后有明显增加的GABA-A受体亚型有α3、α5、β2、β3、γ1、γ2和θ,而GABA-B2R和GABA-B1b则在活化前和活化后均无表达。结论GABA可抑制已活化的CD8^+T细胞的增殖,其活化受GABA相关受体所调节,但其具体机制还有待于进一步探讨。

小鼠CD4^+T细胞活化后4种microRNAs的表达分析

目的:研究小鼠脾脏CD4^+T淋巴细胞活化后微小RNA(microRNA,miRNA)的表达水平。方法:采用CD3/CD28免疫磁珠法刺激培养小鼠脾脏CD4+T细胞24 h,应用流式细胞术检测刺激前后CD4^+T细胞的活化率,使用实时荧光定量PCR技术分别检测培养0 h,6 h,12 h以及24 h后的CD4+T细胞中miR-181d、miR-342-3p、miR-9、miR-122-3p的表达水平。结果:CD3/CD28免疫磁珠法刺激培养24 h后CD4+T细胞活化率由5.2%升高至60.9%,差异有统计学意义(t=22.01,P<0.01)。与培养0 h相比,miR-181d和miR-342-3p在经刺激培养6 h,12 h和24 h后的CD4^+T细胞中的表达水平均明显降低(P<0.05),而miR-9和miR-122-3p的表达各组间的差异无统计学意义(P>0.05)。结论:小鼠脾脏CD4^+T细胞活化后,miR-181d和miR-342-3p的表达明显下调。

CD3／CD28协同刺激诱导抵抗和清除HIV-1感染的检验研究与细胞亚群分析

目的通过CD3／CD28抗体协同刺激活化原代CD4^＋ T细胞，以复制具有抵抗和清除HIV-1能力的“Levine现象”，建立相关机理研究的实验模式，分析效应细胞的亚群特征。方法从外周血单个核细胞中分选高纯度的CD4’T细胞，以PHA／IL-2为对照，经CD3／CD28抗体刺激培养后，以CD45RO、CD62L和CCR7进行单细胞流式分析，鉴定细胞亚群及CCR5、CXCR4表达水平，以实时荧光定量法测定培养上清中的病毒载量。结果CD3／CD28抗体刺激下CD4^＋ T细胞明显增殖活化，原态细胞减少，明显转为记忆细胞表型，特别是M2亚群和TCM亚群细胞增多，未发现典型的TEMRA亚群。与PHA／IL-2相反，CD3／CD28抗体明显下调CCR5，并使早期感染者的病毒载量始终维持低于检出线水平（〈50IU／m1）。结论本研究以“Levine现象”为线索，验证和复制了诱导靶细胞抵抗和清除HIV-1感染的研究体系，为进一步探索新的防治HIV／AIDS的细胞分子机理奠定了基础。

CD28单抗对CD3-AK细胞增殖作用和杀伤效果

目的探讨CD28单抗对细胞增殖效果及细胞毒作用,分析CD28单抗对CD3-AK肿瘤杀伤活性的调节作用。方法制备CD28单克隆抗体,诱导CD3-AK细胞,用倒置显微镜观察细胞数量和形态,用MTT法测定CD3-AK细胞对骨髓瘤细胞的抑制率。结果CD3-AK细胞加入CD28单抗,细胞数量明显增多(t=10.6,P<0.05);对肿瘤细胞的杀伤活性明显增高。结论CD28单抗与CD3单抗联合,具有较强的协同作用,能有效提高CD3-AK的肿瘤杀伤活性。

抗人卵巢癌×抗人CD3×抗CD28V_H单链三特异抗体的胞内可溶表达、纯化及体外活性测定

目的 研究抗人卵巢癌 (ovariancarcinoma ,oc)×抗人CD3×抗CD2 8VH 单链三特异抗体(singlechaintrispecificantibody,scTsAb)在大肠杆菌中的可溶表达与纯化及纯化后产物的活性测定 ,从而为其应用于卵巢癌治疗的临床研究打下基础。方法 将已构建的scTsAb表达载体转化大肠杆菌BL2 1(DE3)Star菌株 ,采用低温 (30℃ )、低剂量IPTG(0 .2mmol L)诱导 ,进行胞内可溶表达。根据抗卵巢癌三特异抗体 (ocTsAb)等电点较高 (pI9.0 ) ,而菌体蛋白大多为酸性蛋白的特点 ,利用DEAE弱阴离子交换层析(pH8.0 )进行一步纯化 ,并利用ELISA及FACS的方法检测纯化后抗卵巢癌三特异抗体的活性。结果 (1)SDS PAGE鉴定低温诱导时可溶比例达到 5 6 %。 (2 )绝大多数菌体蛋白被DEAE层析柱吸附 ,而抗卵巢癌三特异抗体在穿透液中流出 ,SDS PAGE检测纯度达到 90 %。 (3)ELISA结果显示纯化后的抗卵巢癌三特异抗体与重组CD2 8纯抗原 ,Jurkat(CD3+ )细胞膜提取抗原 ,SKOV3细胞膜提取抗原均有特异性结合。 (4 )FACS结果证明纯化后的抗卵巢癌三特异抗体与Jurkat(CD3+ )活细胞、SKOV3活细胞有特异性结合。结论 低温诱导胞内可溶表达的抗人卵巢癌×抗人CD3×抗CD2 8VH 单链三特异抗体经弱阴离子交换层析一步纯化后仍保持原有免疫学活性 。

CD28单抗对CD3AK细胞增殖及表型的影响

CD3AK细胞是用小剂量CD3单抗交联CD3分子而活化的T细胞 ,它具有较强的细胞增殖和细胞毒效能。CD2 8分子则是T细胞激活过程中所需的协同刺激分子 ,可提供T细胞活化所需的第二信号。本文利用CD2 8单抗作为CD2 8分子的配体 ,观察了CD2 8信号途径的激活对CD3AK细胞的影响。结果显示CD2 8单抗可增强CD3AK细胞的增殖活性和趋化团聚形成集落的能力 ,并优先引起CD4+T细胞的增殖。

抗 CD3 、 CD28 单抗对人 T 淋巴细胞共刺激作用的影响因素

以抗 Ｃ Ｄ３ 和抗 Ｃ Ｄ２８ 作为 Ｔ 细胞激活的第一和第二信号， 观察二者不同浓度， 不同作用顺序和不同作用时间对人 Ｔ淋巴细胞增殖反应的影响。结果显示单一的抗 Ｃ Ｄ３ 和抗 Ｃ Ｄ２８ 不能刺激 Ｔ 细胞增殖， 只有同时或在一定时间内接受二者的共同刺激才能促使 Ｔ 细胞增殖。单独接受抗 Ｃ Ｄ３ ２４ｈ 或抗 Ｃ Ｄ２８ １６ｈ 后， Ｔ 细胞对相应的另一信号刺激呈低反应性， 这一现象可能与 Ｔ细胞耐受及自身免疫病的发生有关。

同种异基因抗原特异性调节性T细胞的体外扩增

目的建立用人B淋巴细胞体外获得大量的同种异基因抗原特异性调节性T(Treg)细胞的方法,以此检测扩增细胞的表型及其免疫无能性和免疫抑制性。方法第1轮扩增将免疫磁珠分选的人CD4+CD25+T细胞和人B淋巴细胞按1∶4体外混合培养,并加入外源白介素-2(IL-2)和抗-CD28;将第1轮扩增得到的Treg细胞用抗-CD3/CD28包被的免疫磁珠和IL-2刺激,做第2轮扩增以获得更多数量的抗原特异性Treg细胞,分为添加和或未添加免疫抑制剂雷帕霉素(RAPA)2组(n=3)。结果经过2轮的扩增后,在第2轮扩增中未添加RAPA组扩增1×103倍,纯度>80%;添加RAPA组扩增0.8×103倍,纯度>90%。添加RAPA组得到的Treg细胞的Foxp3、CT-LA4、CD39表达水平高于未添加RAPA组,但是HLA-DR变化不大;未添加RAPA组扩增得到的Treg细胞分泌低水平的IL-2、IL-17、IL-4和IFN-γ,而添加RAPA组得到的Treg细胞几乎不分泌上述各种细胞因子,前者表现出部分免疫反应无能性,后者表现出完全的免疫反应无能性,两者都表现出免疫抑制性功能特征。人B淋巴细胞扩增得到的抗原特异性Treg细胞能够极大地抑制同源抗原引起的免疫反应,而对多克隆刺激的免疫反应抑制能力较弱。结论用人B细胞体外扩增抗原特异性Treg细胞,再通过抗-CD3/CD28包被的免疫磁珠进一步刺激可以体外获得大量的抗原特异性的Treg细胞,加入RAPA后可有效地提高Treg细胞的纯度和免疫抑制力且呈现抗原特异性。

不同刺激物对细胞因子诱导的杀伤细胞分泌细胞因子的影响

目的:探讨抗CD3单抗联合不同浓度的抗CD28单抗对细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞细胞因子分泌的影响。方法:取6例肿瘤患者的外周血,分离、诱导培养,获取CIK细胞。CIK细胞成熟后用1.0 mg/L抗CD3单抗分别联合0.5、1.0、2.5 mg/L抗CD28单抗进行活化,使用ELISA方法检测细胞因子IFN-γ、IL-10、IL-2、TNF-α的分泌水平,并用胞内细胞染色法检测CD3+CD8+T细胞中IFN-γ、穿孔素的表达水平。以50μg/L佛波酯联合750μg/L离子霉素共刺激的CIK细胞作对照。结果:抗CD3单抗联合不同浓度抗CD28单抗组CIK细胞IFN-γ、IL-10、IL-2、TNF-α分泌水平和胞内穿孔素表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:抗CD3单抗联合不同浓度抗CD28单抗共刺激对CIK细胞细胞因子的分泌无影响,临床上可选择1.0 mg/L抗CD3单抗联合0.5 mg/L抗CD28单抗活化淋巴细胞。